Медицинский эксперт статьи
Новые публикации
Гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови
Последняя редакция: 17.10.2021
Весь контент Web2Health проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.
У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.
Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.
Хорошим по пролиферативному потенциалу и репопуляционным возможностям кроветворных клеток источником гемопоэтических стволовых клеток выступает пуповинная кровь. Неоднократно показано, что к моменту родов пуповинная кровь содержит достаточно большое количество слабо коммитированных клеток-предшественников гемопоэза. Некоторые авторы считают, что преимущество трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови заключается в отсутствии необходимости поиска донора, совместимого по HLA-антигенам. По их мнению, незрелость иммунной системы новорожденного обуславливает пониженную функциональную активность иммунокомпетентных клеток и соответственно более низкую, чем при трансплантации костного мозга, частоту развития тяжелой реакции "трансплантат против хозяина". При этом выживаемость клеточного трансплантата пуповинной крови не ниже, чем клеток костного мозга, даже в случае использования меньшего числа ГСК, вводимых из расчета на 1 кг массы тела больного. Однако, на наш взгляд, вопросы оптимального количества трансплантируемых клеток пуповинной крови, необходимого для эффективного приживления в организме реципиента, их иммунологической совместимости и еще ряд аспектов проблемы трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови требуют более серьезного анализа.
[Получение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Процедура получения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови требует ее забора немедленно после рождения ребенка и отделения его от последа, когда плацента находится in utero или ex utero, а также при кесаревом сечении, но тоже ex utero. Показано, что в случае сокращения времени от момента рождения до отделения новорожденного от плаценты до 30 секунд объем получаемой пуповинной крови возрастает в среднем на 25-40 мл. При более позднем проведении данной процедуры такое же количество крови теряется. Установлено, что раннее отделение ребенка от последа не влечет за собой никаких отрицательных последствий для новорожденного.
В Российском НИИ гематологии и трансфузиологии разработаны эффективные и малозатратные технологии получения пуповинной крови как при физиологических родах ((70,2+25,8) мл), так и при кесаревом сечении ((73,4+25,1) мл). Предложена методика сепарации пуповинной крови с достаточно высоким выходом ядросодержащих и мононуклеарных клеток - (83,1+9,6) и (83,4+14,1)% соответственно. Усовершенствован способ криоконсервирования пуповинной крови, что обеспечивает высокую сохранность мононуклеарных клеток и CFU-GM - (96,8+5,7) и (89,6+22,6)% соответственно. Определена эффективность дренажного способа забора пуповинной крови с использованием контейнера “Компопласт-300” (Россия). Забор пуповинной крови авторы проводили сразу после рождения ребенка и отделения его от последа, в условиях размещения плаценты in utero или ex utero. Перед пункцией пуповинной вены пупочный канатик однократно обрабатывали 5% настойкой йода, а затем дважды - 70% этиловым спиртом. Кровь оттекала по соединительным трубкам в контейнер самопроизвольно. Продолжительность процедуры забора занимала не более 10 минут. Объем 66 собранных дренажным способом образцов пуповинной крови в среднем составил (72+28) мл, а количество лейкоцитов в усредненном полном объеме образца - (1,1+0,6) х х 107. При анализе пуповинной крови на стерильность (бактериальная контаминация, ВИЧ-1, вирусы гепатитов В и С, сифилис и цитомегаловирусная инфекция) только в одном образце были выявлены IgG-антитела к вирусу гепатита С. В другом исследовании плаценту сразу после ее рождения укладывали фетальной поверхностью книзу на специальную рамку, пуповину обрабатывали 5% раствором йода и 75% этиловым спиртом. Вену пуповины дренировали при помощи иглы от трансфузионной системы (G16). Кровь стекала в контейнер самопроизвольно. Объем крови, забираемой таким способом, в среднем составлял (55+25) мл. В работе G. Kogler и соавторов (1996) пуповинную кровь забирали закрытым способом и получили большие объемы крови - в среднем (79+26) мл. Авторы отмечают, что среди 574 образцов пуповинной крови около 7% содержат менее 40 мл крови, что не позволяет использовать их для трансплантации. K. Isoyama и соавторы (1996), забирая кордовую кровь путем активной эксфузии при помощи шприцов, получали в среднем 69,1 мл крови (объем пуповинной крови варьировал от 15 до 135 мл). Наконец, A. Abdel-Mageed PI соавторам (1997) посредством катетеризации пуновинной вены удалось получить в среднем 94 мл пуповинной крови (от 56 до 143 мл).
Для снижения риска ятрогенного инфицирования и загрязнения материнскими выделениями разработана закрытая система забора крови, основанная на широко применяемой трансфузиоиной системе Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA), содержащей 62,5 мл CPDA (citrate-phosphate-dextrose with adenine) в качестве антикоагулянта. Технология получения материала имеет первоочередное значение для подготовки качественного образца относительно объема, содержания и чистоты клеточной суспензии. Из существующих методов забора пуповинной крови, которыеусловно классифицируют на закрытую, полуоткрытую и открытую системы, следуетотдавать предпочтение первой, поскольку в закрытой системе существенно снижается риск микробного загрязнения материала, а также контаминации клеточной суспензии материнскими клетками.
A. Nagler и соавторы (1998) провели сравнительный анализ эффективности всех трех систем забора пуповинной крови. В первом варианте процедура осуществлялась в закрытой системе путем эксфузии крови непосредственно в контейнер. Во втором варианте кордовую кровь получали методом активной эксфузии крови шприцамр1 с дальнейшим промыванием вен плаценты и одновременным дренированием крови в контейнер (открытый способ). В третьем варианте кровь забирали в полуоткрытой системе посредством активного извлечения ее шприцами и промывания через артерию пуповины с одновременной эксфузией в контейнер. В первом варианте авторы получили пуповинную кровь в объеме (76,4+32,1) мл при содержании лейкоцитов (10,5+3,6) х 106 в 1мл крови. Во втором варианте соответствующие показатели составили (174,4+42,8) мл и (8,8+3,4) х 106/мл; в третьем - (173,7+41,3) мл и (9,3+3,8) х 106/мл. Наиболее частое инфицирование образцов пуповинной крови отмечалось при использовании открытой системы. Установлена прямая корреляционная зависимость между массой плаценты и объемом извлекаемой крови - с увеличением массы плаценты количество собираемой крови возрастает.
После забора пуповинной крови следует этап сепарации - выделение мононуклеарных клеток и очищение клеточной суспензии от эритроцитов. В условиях эксперимента ядросодержащие клетки выделяют методом их седиментации метилцеллюлозой при лизисе эритроцитов аммония хлоридом. Однако в клинических целях применять метилцеллюлозу не следует, так как потери на ней гемопоэтических стволовых клеток достигают 50-90%. Лизирование эритроцитов в связи с большими объемами рабочего раствора в клинике также почти не проводится, хотя процент выделения таким способом ядросодержащих клеток с фенотипом CD34+, а также клеток-предшественников с функциями CFU-GM и CFU-GEMM значительно выше. Сообщается о появлении нового средства для выделения мононуклеарных клеток в градиенте плотности buyant density solution (BDS72). Это вещество имеет следующие физиологические параметры: pH - 7,4, осмоляльность - 280 мосм/кг, плотность - 1,0720 г/мл. По мнению авторов, с его помощью можно выделить до 100% СD34-позитивных клеток и удалить 98% эритроцитов. Однако в клинике BDS72 пока еще не применяется.
В апробированных методиках выделения ядросодержащих клеток из пуповинной крови обычно используется 10% раствор гидроксиэтилкрахмала или 3% раствор желатины. Эффективность осаждения эритроцитов и выделения ядросодержащих клеток в обоих случаях оказывается примерно равной. Однако в случае применения в качестве седиментирующего вещества желатины удается получить несколько большее количество CFU-GM, чем при использовании гидроксиэтилкрахмала. Предполагается, что различия в эффективности выделения CFU-GM обусловлены неодинаковой скоростью осаждения отдельных фракций ядросодержащих клеток или же способностью молекул гидроксиэтилкрахмала абсорбироваться на поверхности рецепторов гемопоетических клеток и тем самым блокировать их чувствительность к колониестимулирующим факторам, которые применяют при культивировании CFU-GM in vitro. Тем не менее, оба седиментатора вполне могут быть пригодны для выделения ядросодержащих клеток при создании масштабных банков пуповинной крови.
Методы сепарации и криоконсервирования пуповинной крови в принципе не отличаются от тех, которые применяются в работе с кроветворными стволовыми клетками периферической крови и костного мозга взрослых доноров. Но при заготовке большого количества образцов пуповинной крови для ее банков способы сепарации должны быть, прежде всего, малозатратными. Поэтому в настоящее время, к сожалению, для клинических нужд используют уже апробированные рутинные методы выделения и криоконсервирования клеток пуповинной крови, а более эффективные, но финансовоемкие методы остаются уделом экспериментаторов.
В целом утвердились критерии оценки количества кроветворных клеток и требования к исследованию образцов пуповинной крови с целью выявления инфекционных возбудителей. Дабы обезопасить трансплантацию гемопоэтических клеток пуповинной крови, все образцы крови необходимо исследовать прежде всего на инфекции, передаваемые гематогенным путем, и генетические заболевания. Ряд авторов рекомендуют дополнительные специальные методы исследования пуповинной крови с целью диагностирования таких генетических заболеваний, как а-талассемия, серповидно-клеточная анемия, дефицит аденозиндезаминазы, агаммаглобулинемия Брутона, болезни Харлера и Понтера.
Согласно рекомендациям Л. Ticheli и соавторов (1998), в каждом образце пуповинной крови необходимо определять количество ядросодержащих клеток, СБ34-позитивных клеток и CFU-GM, провести HLA-типирование, определить группу крови по АВО и ее резус-принадлежность. Кроме того, осуществляют бактериологический посев, серологическое исследование на ВИЧ и цитомегаловирусную инфекцию, HBsAg, вирусный гепатит С, HTLY-I и HTLV-II (Т-клеточный лейкоз человека), сифилис и токсоплазмоз. Обязательной является полимеразная цепная реакция на цитомегаловирусную и ВИЧ-инфекцию.
Сама процедура получения пуповинной крови должна выполняться в строгом соответствии принципам медицинской биоэтики. До начала забора крови необходимо получить согласие беременной женщины на его осуществление. Предварительная беседа с беременной для получения информированного согласия на выполнение всех манипуляций, начиная с эксфузии крови и заканчивая заполнением документации, проводится только медицинскими работниками. Ни в коем случае недопустимо выполнение любой из этих процедур персоналом, имеющим биологическое, химическое, фармацевтическое и другое немедицинское образование, ввиду нарушения установленных норм биоэтики и прав человека. При положительных тестах на носительство HBsAg, наличие антител к возбудителям гепатита С, ВИЧ-инфекции и сифилиса пуповинную кровь не забирают, а образцы уже собранной крови выбраковываются и уничтожаются. Следует отметить, что носительство латентных инфекций у новорожденных встречается намного реже, чем у взрослых, следовательно, вероятность гематогенного переноса и развития инфекционных осложнений при инфузиях кроветворных клеток пуповинной крови существенно ниже, чем в случае использования для трансплантации костного мозга взрослых доноров.
Важным моментом применения пуповинной крови в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества кроветворных стволовых клеток в образце пуповинной крови и доз клеток, необходимых для пересадки. В настоящее время еще не разработаны стандарты оптимального количества клеток пуповинной крови, требуемого для трансплантации. Нет общепринятой точки зрения даже на такие рутинные параметры, как количество СD34-позитивных клеток и CFU-GM. Некоторые авторы оценивают потенциал кроветворных клеток посредством анализа долгосрочных культур с определением содержания колониеобразующих единиц, общих для гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов - CFU-GEMM.
Однако в клинических условиях стандартная оценка трансплантата пуповинной крови включает, как правило, лишь определение количества ядросодержащих или мононуклеарных клеток.
Хранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Некоторые проблемы существут и в технологии хранения гемопоэтических клеток пуповинной крови. При криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток для достижения оптимального режима их замораживания необходимо максимально уменьшить объем пуповинной крови, а также предварительно удалить эритроциты во избежание гемолиза и опасности развития реакции несовместимости по эритроцитарным антигенам (ABO, Rh). Для этих целей пригодны различные способы выделения ядросодержащих клеток. В начале 90-х годов прошлого века наибольшее распространение получил метод выделения ядросодержащих клеток в градиенте плотности на основе фиколла с плотностью 1,077 г/мл или перкола с плотностью 1,080 г/мл. Сепарация пуповинной крови в градиенте плотности позволяет выделить преимущественно мононуклеарные клетки, но приводит к значительным потерям гемопоэтических клеток-предшественников - до 30-50%.
Седиментирующая эффективность гидроксиэтилкрахмала в процессе выделения кроветворных клеток пуповинной крови оценивается по-разному. Одни авторы указывают на низкое качество сепарации с помощью этого метода, другие исследователи, наоборот, среди всех возможных способов отдают предпочтение выделению ГСК пуповинной крови именно с использованием 6% раствора гидроксиэтилкрахмала. При этом подчеркивается высокая эффективность седиментации гемопоэтических клеток, которая, по некоторым данным, достигает от 84% до 90%.
Сторонники иной точки зрения считают, что практически все способы фракционирования сопряжены с большими потерями ядросодержаших клеток и предлагают производить сепарацию путем центрифугирования, разделяя пуповинную кровь на 3 фракции: эритроцитарную, лейкоцитарное кольцо и плазму. Выделяя клетки таким способом, авторы установили, что содержание мононуклеарных клеток, ранних гемопоэтических клеток-предшественников и клеток с иммунофенотипом CD34+ в конечном итоге составило соответственно 90, 88 и 100% от исходного уровня. Подобные величины прироста очищенных этим методом клеток пуповинной крови получены и другими исследователями: после седиментации выделено 92% ядросодержащих, 98% - мононуклеарных, 96% - СD34-позитивных клеток и 106% колониеобразующих единиц.
В конце 90-х годов в качестве седиментирующего средства широкое применение получила желатина. В клинической практике с помощью желатины гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови выделяют с 1994 года. При использовании 3% раствора желатины эффективность выделения ядросодержащих клеток достигает 88-94%. Широкомасштабное применение желатины при создании банка пуповинной крови подтвердило ее преимущества перед другими седиментирующими средствами. Сравнительный анализ эффективности всех вышеперечисленных способов выделения ядросодержащих клеток в условиях их последовательного применения на каждом из тестируемых образцов пуповинной крови доказал, что оптимальным седиментатором по выходу мононуклеарных клеток с фенотипом CD34+/CD45+, а также по числу CFU-GM и CFU-GEMM является 3% раствор желатины. Значительно менее эффективными оказались методы с использованием градиента плотности фиколла, а также применение гидроксиэтилкрахмала и метилцеллюлозы, при которых потери гемопоэтических клеток достигали 60%.
Расширение объемов трансплантации стволовых клеток пуповинной крови связано не только с разработкой методов их получения, но и хранения. Существует немало проблем, непосредственно связанных с подготовкой пуповинной крови к длительному хранению и выбором оптимальной технологии криоконсервирования ее образцов. Среди них - вопросы целесообразности выполнения сепарационных процедур, использования различных криоконсервирующих сред и применения способов подготовки размороженных клеток к трансплантации. Транспортировка нативных образцов пуповинной крови нередко осуществляется из регионов, удаленных от гематологических центров. В связи с этим возникает проблема допустимых сроков хранения пуповинной крови от момента ее получения до начала криоконсервации, что имеет особое значение при создании банков пуповинной крови.
Исследование функциональной активности гемопоэтических клеток пуповинной крови после длительного хранения (до 12 лет) в жидком азоте позволило установить, что около 95% кроветворных клеток на протяжении этого времени не утрачивают свою высокую пролиферативную способность. В работе С. Юрасова и соавторов (1997) доказано, что хранение пуповинной крови при комнатной температуре (22°С) или при температуре 4°С в течение 24 и 48 часов существенно не снижает жизнеспособность кроветворных клеток, которая от исходного уровня составляет соответственно 92 и 88%. Однако в случае продления срока хранения до трех суток количество жизнеспособных ядросодержащих клеток в пуповинной крови значительно уменьшается. В то же время в ходе других исследований установлено, что при хранении в течение 2-3 суток при температуре 22 или 4°С прежде всего страдает жизнеспособность зрелых гранулоцитов, а не гемопоэтических клеток.
На жизнеспособность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови негативное влияние могут оказывать компоненты систем для ее забора. Анализ влияния различных антикоагулянтов, механизм действия которых обусловлен связыванием ионов кальция (ACD, EDTA, XAPD-1), на гемопоэтические клетки-предшественники в условиях хранения пуповинной крови от 24 до 72 часов выявил их отрицательное воздействие на жизнеспособность ядросодержащих клеток. В связи с этим авторы рекомендуют использовать PBS (раствор фосфатного буфера) с добавлением нативного гепарина без консерванта в концентрации 20 ЕД/мл, что, по их мнению, позволяет увеличить длительность хранения нефракционированной пуповинной крови до 72 часов и сберегает функциональную активность колониеобразующих единиц. Однако при исследовании сохранности CFU-GM и CFU-G показано, что время хранения пуповинной крови до начала криоконсервации не должно превышать девяти часов. Очевидно, в данном случае должен действовать принцип, согласно которому при наличии противоречивых данных следует использовать минимальный рекомендуемый срок хранения пуповинной крови и приступать к программируемой заморозке выделенных клеток как можно быстрее.
При замораживании гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в качестве криопротектора обычно используется 10% раствор ДМСО. Однако, помимо выраженного криопротекторного действия, диметилсульфоксид в такой концентрации оказывает и прямой цитотоксический эффект, даже при условии минимальной его экспозиции с кроветворными клетками пуповинной крови. Для уменьшения цитотоксического действия ДМСО применяется нулевая температура экспозиции, повышение скорости проведения всех манипуляций и многократное отмывание после размораживания образцов пуповинной крови.
В Институте гематологии и трансфузиологии АМН Украины с 1995 года развивается научное направление, целью которого является всестороннее исследование пуповинной крови как альтернативного источника стволовых гемопоэтических клеток. В частности, разработаны новые технологии низкотемпературного криоконсервирования гемопоетических клеток нефракционированной и фракционированной пуповинной крови. В качестве криопротектора используется низкомолекулярный медицинский поливинилпиролидон. В основе способа криоконсервирования нефракционированной пуповинной крови лежит оригинальная технология предподготовки клеток к замораживанию и методика специальной обработки клеточной суспензии непосредственно перед трансплантацией.
Одним из важнейших факторов, влияющих на уровень функциональной активности криоконсервируемых гемопоэтических стволовых клеток, является скорость охлаждения клеточной взвеси, особенно в период фазы кристаллизации. Программный подход к решению проблемы скорости и времени замораживания предоставляет большие возможности для создания простых и высокоэффективных методов криоконсервирования, причем без отмывания клеточной взвеси от криопротекторов перед трансплантацией.
Наиболее опасны для жизнеспособности клеток во время их заготовки этапы непосредственного замораживания и размораживания. При замораживании гемопоэтических клеток значительная их часть может разрушаться в момент перехода межклеточной среды из жидкой в твердую фазу - кристаллизации. Для снижения процента гибели клеток используют криопротекторы, механизмы действия и криозащитная эффективность которых достаточно полно освещены в научной литературе.
Перспективным направлением оптимизации методов криоконсервирования костного мозга и клеток пуповинной крови является сочетание в одном растворе низких концентраций нескольких криопротекторов с различным механизмом действия, например, действующего на внутриклеточном уровне ДМСО и гидроксиэтилкрахмала или альбумина, обладающих экстрацеллюлярным ограждающим эффектом.
Для криоконсервации клеток пуповинной крови традиционно используется 20% раствор ДМСО, который, постоянно механически помешивая на ледяной бане, медленно вливают в клеточную взвесь до достижения равного (1:1) соотношения объемов криопротектора и клеточной суспензии. При этом конечная концентрация диметилсульфоксида составляет 10%. Затем клеточную взвесь охлаждают на программной криоустановке со скоростью ГС/мин до -40°С, после чего скорость охлаждения увеличивают до 10°С/мин. После достижения -100°С контейнер с клеточной суспензией помещают в жидкий азот (-196°С). При такой методике криоконсервации сохранность функционально активных мононуклеарных клеток после размораживания достигает 85% от первоначального уровня.
Модификации методик криоконсервации направлены на снижение концентрации ДМСО за счет добавления гидроксиэтилкрахмала (конечные концентрации диметилсульфоксида и гидроксиэтилкрахмала составляют соответственно 5 и 6%). Высокая эффективность такого сочетания криопротекторов наблюдается при замораживании суспензии миелоидных клеток, причем с не меньшей цитопротекцией, чем при использовании одного только 10% раствора диметилсульфоксида. Количество жизнеспособных ядросодержащих клеток достигало 96,7% от исходного уровня, а функциональная их активность, оцененная по числу CFU-GM, составляла 81,8%.
При использовании раствора диметилсульфоксида в концентрациях от 5 до 10% в сочетании с 4% гидроксиэтилкрахмалом (конечная концентрация) установлено, что сохранность СD34-позитивных клеток в таких диапазонах диметилсульфоксида практически не изменяется. В то же время в условиях снижения концентрации диметилсульфоксида от 5 до 2,5% наблюдается массовая гибель клеток пуповинной крови - количество жизнеспособных клеточных единиц снижается с 85,4 до 12,2%. Другие авторы также пришли к заключению, что именно 5 и 10% растворы диметилсульфоксида (в авторском варианте - в комбинации с аутологичной сывороткой) с максимальной эффективностью обеспечивают цитопротекцию при криоконсервировании ГСК пуповинной крови. Кроме того, высокая сохранность последовательно замораживаемых и размораживаемых клеток отмечается в случае сочетания 5 или 10% диметилсульфоксида с 4% раствором гидроксиэтилкрахмала, особенно при контролируемой скорости охлаждения, равной ГС/мин. В еще одной работе использовался криозащитный раствор, состоящий уже из трех ингредиентов - ДМСО, очищенного человеческого альбумина и среды RPMI в пропорции 1:4:5, который добавляли к клеточной суспензии до равного соотношения объемов (конечная концентрация диметилсульфоксида составила 5%). После размораживания на водяной бане при температуре +4ГС сохранность CFU-GM превышала 94%.
Некоторые авторы предлагают использовать для криоконсервирования нефракционированную пуповинную кровь, поскольку в процессе удаления эритроцитов утрачиваются значительные количества гемопоэтических клеток. В этом варианте для защиты мононуклеарных клеток от повреждающего действия криокристаллизации используется 10% раствор диметилсульфоксида. Замораживание проводится при постоянной скорости охлаждения, составляющей ГС/мин, до -80°С, после чего суспензию клеток пуповинной крови опускают в жидкий азот. При данной методике замораживания происходит частичный лизис эритроцитов, поэтому образцы крови не требуют фракционирования. После размораживания клеточную взвесь отмывают от свободного гемоглобина и диметилсульфоксида в растворе человеческого альбумина или в сыворотке аутокрови больного и используют для трансплантации.
Сохранность гемопоэтических клеток-предшественников после размораживания нефракционированной пуповинной крови действительно выше, чем фракционированной, однако в связи с криоустойчивостью части эритроцитов могут возникнуть серьезные посттрансфузионные проблемы вследствие переливания АВО-несовместимых эритроцитов. Кроме того, ощутимо возрастает объем хранимой нефракционированной крови. С клинической точки зрения, все-таки предпочтительнее криоконсервация предварительно выделенных и очищенных от иных клеточных фракций гемопоэтических клеток пуповинной крови.
В частности, разработан способ криоконсервации клеток фракционированной пуповинной крови, позволяющий удалять эритроциты на этапе подготовки к замораживанию, в котором используется 6% раствор гидроксиэтилкрахмала в составе плазмозамещающего раствора “Стабизол”. После размораживания полученная таким способом клеточная суспензия готова к клиническому применению без дополнительных манипуляций.
Таким образом, в настоящее время существует множество достаточно эффективных способов криоконсервирования пуповинной крови. Принципиальное их различие состоит в том, что образцы крови замораживают нефракционированными или подвергают разделению на клеточные фракции на этапе подготовки и заготавливают ядросодержащие клетки без примеси эритроцитов.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
В конце 80-х - начале 90-х годов прошлого века было установлено, что пуповинная кровь, обеспечивающая жизнедеятельность плода в период беременности, отличается высоким содержанием гемопоэтических стволовых клеток. Относительная простота получения клеток пуповинной крови и отсутствие явных этических проблем способствовали применению стволовых клеток пуповинной крови в практической медицине. Первая успешная трансплантация пуповинной крови ребенку с анемией Фанкони послужила отправной точкой для расширения объемов трансплантации стволовых клеток пуповинной крови и создания системы ее банкового обеспечения. В мировой системе банков пуповинной крови крупнейшим является Нью-Йоркский центр плацентарной крови, который состоит на балансе Национального института здоровья США. Число сохраняемых образцов пуповинной крови в этом банке приближается к 20 ООО. Растет и количество реципиентов (в основном дети), которым была произведена успешная трансплантация. Как сообщает Департамент здоровья США, безрецидивный период посттрансплантационной жизни реципиентов ГСК пуповинной крови уже превышает 10 лет.
Это и неудивительно, так как многочисленные исследования гемопоэтического потенциала пуповинной крови показали, что по количеству и качеству самых ранних стволовых клеток она не только не уступает костному мозгу взрослого человека, но и по некоторым показателям превышает его. Более высокий пролиферативный потенциал стволовых клеток пуповинной крови обусловлен онтогенетическими особенностями клеточной сигнализации, наличием на ГСК рецепторов к специфическим факторам роста, способностью клеток пуповинной крови к аутокринной продукции факторов роста, большими размерами и длиной теломер.
Таким образом, геномные и фенотипические особенности стволовых кроветворных клеток пуповинной крови предопределяют качественное приживление трансплантата с высоким потенциалом восстановления донорского гемопоэза в организме реципиента.
Преимущества гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Среди реальных преимуществ использования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови с целью трансплантации перед другими источниками кроветворных клеток следует отметить практически нулевой риск для здоровья донора (если вообще не считать таковым плаценту), а также отсутствие необходимости общей анестезии. Применение пуповинной крови расширяет возможности клеточной трансплантации за счет частично совместимых по HLA-системе трансплантатов (несовместимость от одного до трех антигенов). Отработана методика длительного хранения гемопоэтических клеток пуповинной крови в замороженном состоянии, что увеличивает вероятность получения редких HLA-типов и сокращает время поиска HLA-совместимого трансплантата для аллогенной трансплантации. При этом значительно снижается риск развития некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем. Кроме того, возникает недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использовать клетки пуповинной крови для аутологичной трансплантации.
Однако вследствие малых объемов крови, которые можно собрать из плаценты (в среднем не более 100 мл), на передний план выходит проблема получения максимально возможного количества крови из вены пупочного канатика при строгом соблюдении условия минимального риска бактериальной контаминации получаемых образцов пуповинной крови.
Примитивные гемопоэтические клетки пуповинной крови обычно идентифицируют по наличию на их поверхности гликофосфопротеина CD34, а также на основании их функциональных свойств путем исследования клоногенности или колониеобразования in vitro. Сравнительный анализ показал, что в пуповинной крови и костном мозге максимальное содержание СD34-позитивных клеток во фракции мононуклеаров составляет соответственно 1,6 и 5,0%, максимальный уровень колониеобразующих единиц в субпопуляции СD34+-клеток - 80 и 25%, тотальная эффективность клонирования СD34+-клеток - 88 и 58%, максимальное содержание колониеобразующих клеток с высоким потенциалом пролиферации (HPP-CFC в СD34+-популяции) - 50 и 6,5%. К этому следует добавить, что эффективность клонирования СD34+СD38-клеток и способность отвечать на цитокиновую стимуляцию также выше у гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
Сочетание фенотипических антигенов Thy-1, CD34 и CD45RA подтверждает высокий пролиферативный потенциал кроветворных клеток пуповинной крови, а экспрессия этих трех антигенов на поверхности клеток пуповинной крови свидетельствует об их принадлежности к стволовым клеткам. К тому же установлено, что в пуповинной крови содержатся клетки с фенотипом CD34+, не имеющие маркеров линейной дифференцировки. Уровень в пуповинной крови клеточных субпопуляций с фенотипическим профилем CD34+/Lin составляет около 1% от всего количества СD34-позитивных клеток. Гемопоэтические клетки-предшественники пуповинной крови дают начало как лимфоидной линии клеток, так и полипотентному миелоидному ряду линейной клеточной дифференцировки, что также указывает на их принадлежность к стволовым клеткам.
Как уже упоминалось, существенные различия между костным мозгом и пуповинной кровью заключаются в количестве получаемых при одной процедуре забора используемых для трансплантации гемопоэтических клеток. Если при пересадке костного мозга потери клеточной массы в процессе сепарации, криоконсервирования, размораживания и тестирования допустимы в пределах 40-50%, то для пуповинной крови такие утраты клеток весьма существенны, так как при использовании недостаточного количества ГСК трансплантат может оказаться несостоятельным. По данным G. Kogler и соавторов (1998), для клеточной трансплантации при массе тела реципиента 10 кг потенциальными трансплантатами (общая численность собранных образцов пуповинной крови - 2098) могут быть все образцы пуповинной крови, при массе тела 35 кг - 67%, и лишь 25% образцов смогут обеспечить эффективную трансплантацию у пациентов с массой тела 50-70 кг. Такая клиническая ситуация свидетельствует о необходимости оптимизации и повышения эффективности существующих методов забора, размножения и хранения клеток пуповинной крови. Поэтому в настоящее время в литературе широко обсуждаются вопросы стандартизации методов забора, тестирования, сепарации и криоконсервирования пуповинной крови для создания банков крови, ее применения в клинике, а также оговариваются условия и сроки хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
Использование гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в медицине
Обычно из пуповинной крови удается выделить до 106 гемопоэтических стволовых клеток, редко больше. В связи с этим до сегодняшнего дня остается открытым вопрос о достаточности такого количества гемопоэтических клеток пуповинной крови для восстановления кроветворения взрослого реципиента. Мнения по этому поводу разделились. Некоторые исследователи полагают, что такого количества вполне достаточно для трансплантации детям, но слишком мало для пересадки взрослому человеку, для которого оптимальным является введение (7-10) х 106 СD34-позитивных клеток на 1 кг массы тела - в среднем 7 х 108 на одну трансплантацию. Из этих расчетов следует, что один образец пуповинной крови содержит в 700 раз меньше гемопоэтических стволовых клеток, чем требуется для одной трансплантации взрослому пациенту. Однако такая количественная оценка сделана по аналогии с количеством переливаемых клеток костного мозга и совершенно не учитывает онтогенетических особенностей гемопоэза.
В частности, игнорируется факт более высокого пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови по сравнению с кроветворными клетками-предшественниками костного мозга. Результаты исследования колониеобразующего потенциала in vitro позволяют полагать, что одна доза пуповинной крови способна обеспечить реконституцию гемопоэза взрослого реципиента. С другой стороны, не следует забывать, что количество ГСК уменьшается даже в процессе эмбрионального развития: содержание СD34-позитивных клеток в пуповинной крови линейно снижается в 5 раз в сроки от 20 недель (кровь для исследования получена при преждевременном прерывании беременности) до 40 недель гестации (период физиологических родов), что сопровождается паралелльной, перманентно нарастающей экспрессией маркеров линейной цитодифференциации.
Из-за отсутствия стандартизированного подхода к количественному определению клеток-предшественников в образцах пуповинной крови споры по поводу оптимальной дозы гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови продолжаются. Часть исследователей считают, что в качестве критериев подбора образцов пуповинной крови можно использовать количество ядросодержащих клеток и мононуклеаров, перерасчитанное на массу тела реципиента, то есть, их дозу. Некоторые авторы полагают, что минимальный количественный порог СD34+-клеток даже для проведения аутотрансплантации ГСК составляет 2 х 106/кг. При этом увеличение дозы гемопоэтических клеток до 5 х 106 клеток/кг (всего в 2,5 раза) уже обеспечивает более благоприятное течение раннего посттрансплантационного периода, снижает частоту инфекционных осложнений и сокращает продолжительность периода превентивной антибиотикотерапии.
По данным E. Gluckman и соавторов (1998), в онкогематологии условием для успешной трансплантации клеток пуповинной крови является введение не менее 3,7 х 107 ядросодержащих клеток из расчета на 1 кг массы тела реципиента. При снижении дозы гемопоэтических стволовых клеток до 1 х 107 и менее ядросодержащих клеток на 1 кг массы тела пациента резко возрастает риск несостоятельности трансплантата и рецидива онкозаболевания крови. Следует признать, что минимальное количество клеток-предшественников, необходимых для быстрого восстановления гемопоэза после аллотрансплантации ГСК, пока еще неизвестно. Теоретически этого можно достичь при помощи одной клетки, но в клинической практике трансплантации костного мозга быстрое и стабильное приживление гарантируется переливанием по крайней мере (1-3) х 108 ядросодержащих клеток на 1 кг массы тела пациента.
Недавно проведенное детальное исследование по определению оптимального количества ГСК в онкогематологии включало наблюдение за пациентами трех групп, выделенных в зависимости от содержания СD34-позитивных клеток в трансплантируемом материале. Больным первой группы вводили (3-5) х 106 клеток/кг. Доза ГСК у пациентов второй группы составила (5-10) х 106 клеток/кг, а больным третьей группы трансплантировали более 10 х 106 СD34+-клеток/кг. Лучшие результаты наблюдались в группе реципиентов, получавших трансплантат с количеством СD34-позитивных клеток, равным (3-5) х 106/кг. При увеличении дозы трансплантируемых клеток свыше 5 х 106/кг статистически значимых преимуществ выявлено не было. При этом очень большое содержание ГСК в трансплантате (> 10 х х 106/кг) сопряжено с реинфузией значительного количества резидуальных клеток опухоли, что приводит к рецидиву заболевания. Прямой связи между количеством трансплантированных аллогенных клеток-предшественников и развитием реакции “трансплантат против хозяина” установлено не было.
Накопленный мировой опыт трансплантации ГСК пуповинной крови подтверждает их высокий репопуляционный потенциал. Скорость приживления трансплантата пуповинной крови коррелирует с количеством введенных ядросодержащих клеток. Лучшие результаты наблюдаются при трансплантации 3 х 107/кг, в то время как для костного мозга эта доза составляет 2 х 108/кг. По данным координационных центров, в конце 2000 года в мире было выполнено 1200 пересадок клеток пуповинной крови, преимущественно от доноров-родственников (83%). Очевидно, что кордовую кровь следует рассматривать как альтернативу костному мозгу для трансплантации больным с гемобластозами.
Вместе с тем, неонатальная природа кордового источника кроветворной ткани вселяет оптимизм в силу наличия функциональных особенностей ее ГСК. При этом только клинический опыт может дать ответ на вопрос о достаточности одного образца пуповинной крови для восстановления гемопоэза взрослого реципиента с аплазией кроветворения. Трансплантация клеток пуповинной крови используется в программах лечения многих заболеваний опухолевой и неопухолевой природы: лейкозы и миелодиспластические синдромы, неходжкинская лимфома и нейробластома, апластическая анемия, врожденные анемии Фанкони и Даймонда-Блекфена, дефицит адгезии лейкоцитов, синдром Барра, болезнь Гюнтера, синдром Харлера, талассемия.
Пристального внимания и отдельного исследования заслуживают иммунологические аспекты трансплантации кроветворных клеток пуповинной крови. Показано, что в случае пересадки стволовых клеток пуповинной крови от доноров с неполной HLA-совместимостью результаты трансплантации оказываются вполне удовлетворительными, что, по мнению авторов, указывает на меньшую иммунореактивность клеток пуповинной крови, чем костного мозга.
Детальное изучение клеточного состава пуповинной крови выявило особенности как фенотипического спектра эффекторных клеток иммунной системы, так и их функциональной активности, что позволило рассматривать кордовую кровь как источник ГСК с относительно низким риском развития реакции 'трансплантат против хозяина”. Среди признаков функциональной незрелости иммунокомпетентных клеток пуповинной крови следует отметить дисбаланс выработки цитокинов и снижение чувствительности к цитоки- новой регуляции иммунного ответа. Возникающее вследствие этого угнетение активности цитотоксических лимфоцитов считается фактором, способствующим формированию иммунологической толерантности к трансплантируемой гемопоэтической ткани. В популяции лимфоцитов пуповинной крови, в отличие от периферической крови и костного мозга взрослых доноров, преобладают неактивные, незрелые лимфоциты и клетки-супрессоры. Это свидетельствует о пониженной готовности Т-лимфоцитов пуповинной крови к иммунному ответу. Важной особенностью моноцитарной популяции клеток пуповинной крови является низкое содержание функционально полноценных и активных антигенпрезентирующих клеток.
С одной стороны, невысокая степень зрелости эффекторных клеток иммунной системы в пуповинной крови расширяет показания к ее применению в клинике, так как эти особенности обеспечивают снижение интенсивности иммунного конфликта между клетками донора и реципиента. Но, с другой стороны, известно о существовании корреляции между степенью развития реакции “трансплантат против хозяина” и противоопухолевым эффектом трансплантации, то есть, развитием эффекта “трансплантат против лейкоза”. В связи с этим было проведено исследование противоопухолевой цитотоксичности клеток пуповинной крови. Полученные результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на действительно ослабленный ответ иммунокомпетентных клеток пуповинной крови на антигенную стимуляцию, активирующиеся в первую очередь лимфоциты являются природными киллерами и киллероподобными клетками, которые принимают активное участие в механизмах реализации противоопухолевой цитотоксичности. Кроме того, в пуповинной крови обнаружены субпопуляции лимфоцитов с фенотипом CD16+CD56+ и CD16"TCRa/p+. Предполагается, что именно эти клетки в активированной форме реализуют реакцию “трансплантат против лейкоза”.
В Институте онкологии АМН Украины криоконсервированные гемопоэтические клетки пуповинной крови вводились онкологическим больным со стойкими гипоплазиями кроветворения вследствие химио- и радиотерапии. У таких пациентов трансплантация гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови достаточно эффективно восстанавливала угнетенное кроветворение, о чем свидетельствовало стойкое повышение содержания зрелых форменных элементов в периферической крови, а также увеличение показателей, характеризующих состояние клеточного и гуморального иммунитета. Стабильность репопуляционного эффекта после пересадки кроветворных клеток пуповинной крови позволяет продолжать лучевую и химиотерапию, не прерывая курс лечения. Имеются сведения о более высокой эффективности аллотрансплантации стволовых клеток пуповинной крови онкогематологическим больным: годовой риск развития рецидива опухолевого заболевания при их применении составлял 25% против 40% у пациентов с пересаженным алло- генным костным мозгом.
Механизм действия криоконсервированных стволовых клеток пуповинной крови следует считать результатом гуморальной стимуляции кроветворения реципиентов, вызванной уникальной способностью неонатальных клеток к аутокринной продукции гемопоэтических факторов роста, а также следствием временного приживления донорских клеток (как подтверждение - достоверное повышение содержания фетального гемоглобина периферической крови реципиентов на 7-15-е сутки после трансфузии в сравнении с исходными данными). Отсутствие у реципиентов пуповинной крови посттрансфузионных реакций - результат относительной толерантности ее иммунокомпетентных клеток, а также доверительный критерий биологической полноценности криоконсервированного материала.
Клетки-предшественники Т-лимфоцитов-киллеров пуповинной крови способны к активации под влиянием экзогенной цитокиновой стимуляции, что используется с целью разработки новых ex vivo и in vivo методик индукции противоопухолевой цитотоксичности лимфоидных элементов трансплантата для последующей иммунотерапии. Кроме того, “незрелость” генома иммунокомпетентных клеток пуповинной крови позволяет применять их для усиления противоопухолевой активности методами молекулярного моделирования.
Сегодня пуповинная кровь нашла широкое применение прежде всего в детской гематологии. У детей с острыми лейкозами аллотрансплантация гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, по сравнению с аллотрансплантацией костного мозга, значительно снижает частоту развития реакции “трансплантат против хозяина”. Однако при этом отмечается более длительный период нейтро- и тромбоцитопении, и, к сожалению, более высокий уровень 100-дневной посттрансплантационной смертности. Более продолжительный период восстановления содержания в периферической крови гранулоцитов и тромбоцитов может быть обусловлен недостаточной дифференцировкой отдельных субпопуляций СD34-позитивных клеток пуповинной крови, о чем свидетельствуют невысокий уровень поглощения радиоактивного родамина и низкая экспрессия на их поверхности антигенов CD38.
В то же время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови взрослым больным, выполненная по причине отсутствия как совместимого неродственного донора костного мозга, так и возможности произвести мобилизацию аутологических ГСК, показала высокую годовую безрецидивную выживаемость в группе пациентов в возрасте не старше 30 лет (73%). Расширение возрастного диапазона реципиентов (18-46 лет) приводило к снижению выживаемости до 53%.
Количественный анализ клеток с фенотипом CD34+ в костном мозге и пуповинной крови выявил более высокое (в 3,5 раза) их содержание в костном мозге, однако в пуповинной крови отмечено значительное преобладание клеток с фенотипическим профилем CD34+HLA-DR .Известно,чтоклеткикровисиммунологическими маркерами CD34+HLA-DR пролиферируют активнее, чем клетки с иммунофенотипом CD34+HLA-DR+, что подтверждено в экспериментальных исследованиях роста долгосрочной гемопоэтической культуры клеток in vitro. Примитивные клеточные предшественники с фенотипом CD34+CD38 содержатся как в пуповинной крови, так и в костном мозге, но клетки пуповинной крови с маркерным набором CD34+CD38 обладают более высокой клоногенной активностью, чем кроветворные клетки того же фенотипа, выделенные из костного мозга взрослых доноров. Кроме того, клетки пуповинной крови с иммунофенотипом CD34+CD38 быстрее пролиферируют в ответ на стимуляцию цитокинами (IL-3, IL-6, G-CSF) и воспроизводят в 7 раз больше колоний в долгосрочных культурах, чем клетки костного мозга.
Банки стволовых клеток пуповинной крови
Для должного развития новой области практической медицины - трансплантации стволовых клеток пуповинной крови, как и для осуществления пересадок гемопоэтических стволовых клеток костного мозга, необходимо наличие разветвленной сети банков крови, которые уже созданы в США и Европе. Внутригосударственные сети банков пуповинной крови объединяет Ассоциация банков Netcord. Целесообразность создания международного объединения банков пуповинной крови определяется тем, что для выполнения неродственных трансплантаций необходимо большое количество типированных образцов пуповинной крови, позволяющее подобрать HLA-идентичного донора. Только учреждение системы банков с хранением в них образцов крови различных HLA-типов может реально разрешить проблему поиска необходимого донора. Организация такой системы банков пуповинной крови требует предварительной разработки этических и юридических норм, которые в настоящее время продолжают обсуждаться на международном уровне.
Для создания банков пуповинной крови в Украине предстоит отработать целый ряд положений и документов.
Прежде всего, это вопросы стандартизации способов забора, фракционирования и замораживания пуповинной крови. Необходимо регламентировать правила забора пуповинной крови в родильных домах в соответствии с требованиями медицинской этики, определить минимальный объем пуповинной крови, обеспечивающий успешную трансплантацию. Следует провести сравнение и стандартизацию различных критериев оценки качества и количества кроветворных клеток-предшественников, а также методов HLA-типирования и способов диагностики генетических и инфекционных заболеваний, которые могут передаваться при инфузии клеток пуповинной крови, установить общие критерии отбора здоровых доноров. Стоит обсудить и вопросы создания отдельных хранилищ для сыворотки, клеток и ДНК, полученных из пуповинной крови.
Совершенно необходима организация компьютерной сети данных о пуповинной крови для осуществления взаимосвязи с регистрами доноров костного мозга. Для дальнейшего развития клеточной трансплантологии нужно разработать специальные протоколы сравнения результатов трансплантации пуповинной крови и костного мозга от HLA-идентичных родственников и неродственных доноров. В решении этических и юридических проблем клинического применения клеток пуповинной крови может помочь стандартизация документации, включающей информированное согласие родителей, а также извещение матери или родственников о выявленных у ребенка генетических и/или инфекционных болезнях.
Определяющим условием развития клеточной трансплантологии в Украине будет принятие Национальной программы донорства стволовых клеток и развитие международного сотрудничества с другими странами посредством Мировой донорской костномозговой ассоциации (WMDA), Национальной донорской костномозговой программы США (NMDP) и иных регистров.
Обобщая пока еще короткую историю развития трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, отметим, что первые предположения о возможности применения в клинике пуповинной крови, высказанные еще в начале 70-х годов, подтвердились в 80-е годы результатами экспериментальных исследований на животных, а в 1988 году уже была проведена первая в мире трансплантация кроветворных клеток пуповинной крови человеку, после чего начала создаваться мировая сеть банков пуповинной крови. Через 10 лет число больных с пересаженными кроветворными клетками пуповинной крови приблизилось к 800. Среди них были пациенты с различными заболеваниями опухолевой (лейкозы, лимфомы, солидные опухоли) и неопухолевой (врожденные иммунодефициты, анемии, болезни, связанные с нарушением обмена веществ) природы.
В пуповинной крови содержание ранних и коммитированных клеточных предшественников выше, чем в периферической крови взрослого человека. По количеству гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц и их пролиферативному потенциалу пуповинная кровь значительно превосходит периферическую кровь взрослых даже после введения ростовых факторов. В долгосрочных клеточных культурах in vitro отмечена большая пролиферативная активность и жизнеспособность клеток пуповинной крови, чем клеток костного мозга. Критическими моментами в трансплантации стволовых клеток пуповинной крови являются количество и кроветворный потенциал ядросодержащих клеток, наличие цитомегаловирусной инфекции, HLA-совместимость донора и реципиента, масса тела и возраст больного.
Тем не менее, трансплантацию стволовых клеток пуповинной крови следует рассматривать как альтернативу пересадке костного мозга с целью лечения тяжелых заболеваний крови, в первую очередь у детей. Клинические проблемы трансплантации клеток пуповинной крови постепенно разрешаются - уже существуют достаточно эффективные методы забора, сепарации и криоконсервации клеток пуповинной крови, обеспечиваются условия для формирования банков пуповинной крови, усовершенствуются способы тестирования ядросодержащих клеток. Оптимальными для сепарации при масштабной заготовке гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови при создании банков следует считать 3% раствор желатины и 6% раствор гидроксиэтилкрахмала.
П. Перехрестенко и соавторы (2001) справедливо отмечают, что трансплантация стволовых клеток пуповинной крови должна занять надлежащее место в комплексе лечебных мероприятий по преодолению депрессий кроветворения различного генеза, поскольку ГСК пуповинной крови отличаются рядом существенных преимуществ, среди которых немаловажным является относительная простота их заготовки, отсутствие риска для донора, низкая контаминация неонатальных клеток вирусами и сравнительно невысокая себестоимость пересадки. Некоторые авторы указывают на то, что трансплантация клеток пуповинной крови реже, чем пересадка клеток костного мозга, сопровождается осложнениями, связанными с реакцией “трансплантат против хозяина”, что обусловлено, по их мнению, слабой экспрессией на клетках пуповинной крови HLA-DR антигенов и их незрелостью. Тем не менее, основной популяцией ядерных клеток пуповинной крови являются Т-лимфоциты (СDЗ-позитивные клетки), содержание которых составляет около 50%, что на 20% меньше, чем в периферической крови взрослого человека, однако фенотипические различия субпопуляций Т-клеток из этих источников незначительны.
Среди факторов, прямо влияющих на выживаемость при трансплантации стволовых клеток пуповинной крови, следует отметить возраст больных (лучшие результаты наблюдаются у реципиентов в возрасте от года до 5 лет), раннюю диагностику заболевания и форму лейкоза (эффективность значительно выше при острых лейкозах). Большое значение имеют доза ядросодержащих клеток пуповинной крови, а также их HLA-совместимость с реципиентом. Не случайно анализ клинической эффективности трансплантации ГСК пуповинной крови в онкогематологии свидетельствует о лучших результатах лечения при использовании родственных трансплантатов: годичная безрецидивная выживаемость в этом случае достигает 63%, тогда как при неродственной трансплантации - всего 29%.
Таким образом, наличие большого количества стволовых клеток в пуповинной крови и высокая репопуляционная способность неонатальных гемопоэтических стволовых клеток позволяют использовать их для аллогенной трансплантации у онкогематологических больных. Однако следует обратить внимание на то, что рекапитуляция гемопоэза после трансплантации кроветворных клеток пуповинной крови “растянута во времени”: восстановление содержания в периферической крови нейтрофилов обычно наблюдается к концу 6-й недели, а явления тромбоцитопении исчезают, как правило, через 6 месяцев. Кроме того, незрелость кроветворных клеток пуповинной крови вовсе не исключает иммунологических конфликтов: тяжелое течение острой и хронической реакции “трансплантат против хозяина” наблюдается соответственно у 23 и 25% реципиентов. Рецидивы острого лейкоза к концу первого года после пересадки клеток пуповинной крови отмечаются в 26% случаев.