^

Здоровье

Стволовые клетки и регенеративно-пластическая медицина

Сегодня мало кто из практических врачей не знает о развитии нового направления в лечении тяжелейших, ранее силами традиционной и нетрадиционной медицины неизлечимых заболеваний. Речь идет о регенеративно-пластической медицине, основанной на использовании регенерационного потенциала стволовых клеток. Вокруг развивающегося направления возникла беспрецедентная научная дискуссия и околонаучная шумиха, во многом созданная благодаря информационным гиперболам Всемирной сети Internet. За очень короткое время лабораторные исследования терапевтических возможностей стволовых клеток вышли за пределы эксперимента и стали активно внедряться в практическую медицину, что породило массу проблем научного, этического, религиозного, юридического и законодательного плана. Государственные и общественные институции оказались явно не готовыми к скорости перехода стволовых клеток из чашек Петри в системы для внутривенного введения, что не идет на пользу как обществу в целом, так и конкретному страждущему человеку. В невообразимом по количеству и качеству объеме сведений о возможностях стволовых клеток нелегко разобраться и специалистам (каковых вообще-то и нет, поскольку каждый пытается освоить новое веянье науки самостоятельно), не говоря уже о врачах, непосредственно не занимающихся регенеративнопластической медициной.

Для чего же нужны подобные эксперименты и нужны ли они вообще?

На первый взгляд, создание клеточных межвидовых химер является плодом безудержной фантазии забывшего о биоэтике ученого-фанатика. Однако именно этот подход значительно расширил наши фундаментальные знания об эмбриогенезе, поскольку позволил провести подсчет количества клеток, необходимых для органогенеза (образования печени, головного мозга, кожи, органов иммунной системы). Кроме того (пожалуй, это главное в биологии ЭСК), генетики получили в свое распоряжение уникальный инструмент, с помощью которого при химеризации зародышей можно установить функциональное предназначение генов. Сначала специальной методикой двойного нокаута в ЭСК “выключают” исследуемую пару генов. Затем такие ЭСК вводят в бластоцисту и отслеживают изменения, возникающие в организме развивающегося химерного зародыша. Таким образом были установлены функции генов sf-1 (развитие надпочечника и половых органов), urt-l (закладка почки), mуоD (развитие скелетных мышц), gata-l-4 (закладка эритро- и лимфопоэза). Кроме того, в ЭСК лабораторных животных можно ввести (трансфецировать) еще не изученные гены человека для определения их функции с помощью химерного зародыша.

Но, как правило, оправдание эксперимента получением новых фундаментальных знаний не встречает поддержки у широкой аудитории. Приведем пример прикладного значения химеризации с помощью ЭСК. В первую очередь, это ксенотрансплантация, то есть, пересадка органов животного человеку. Теоретически создание клеточных химер “человек-свинья” позволяет получить животное, значительно более близкое по антигенным характеристикам к донору ЭСК, что в разных клинических ситуациях (сахарный диабет, цирроз печени) может спасти жизнь больному человеку. Правда, для этого нужно сначала научиться возвращать свойство тотипотентности геному зрелой соматической клетки, после чего ее можно будет вводить в развивающийся зародыш свиньи.

Сегодня свойство ЭСК в специальных условиях культивирования делиться практически бесконечно используется для наработки тотипотентной клеточной массы с последующей ее дифференциацией в специализированные клетки, например дофаминергические нейроны, которые затем трансплантируются пациенту с болезнью Паркинсона. При этом трансплантации обязательно предшествует направленная дифференцировка полученной клеточной массы в нужные для лечения специализированные клетки и очистка последних от недифференцировавшихся клеточных элементов.

Как выяснилось в дальнейшем, угроза канцерогенеза была далеко не единственной преградой на пути клеточной трансплантации. Спонтанно ЭСК в эмбриоидных тельцах дифференцируются гетерогенно, то есть, образуют производные самых разнообразных клеточных линий (нейроны, кератиноциты, фибробласты, эндотелиоциты). В поле зрения микроскопа в этом случае среди клеток разнообразных фенотипов выделяются кардиомиоциты, каждый из которых сокращается в своем ритме. Однако для лечения больного необходимо иметь чистые популяции клеток: нейронов - при инсульте, кардиомиоцитов - при инфаркте миокарда, β-клеток поджелудочной железы - при сахарном диабете, кератиноцитов - при ожогах и т.д.

Следующий этап развития клеточной трансплантологии был связан с разработкой технологий получения достаточного количества (миллионы клеток) таких чистых клеточных популяций. Поиск факторов, вызывающих направленную дифференцировку ЭСК, носил эмпирический характер, поскольку последовательность их синтеза в процессе эмбриогенеза оставалась неизвестной. Сначала было установлено, что образование желточного мешка индуцируется добавлением в культуру ЭСК цАМФ и ретиноевой кислоты. Линии гемопоэтических клеток образовывались при наличии в среде культивирования 1L-3, SCF, фактора роста фибробластов (FGH), инсулиноподобного фактора роста (IGF-1), 1L-6 и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-СSF). Клетки нервной системы формировались из ЭСК после удаления LIF и слоя фибробластов, выполняющего роль фидера. После обработки ретиноевой кислотой в присутствии эмбриональной сыворотки ЭСК начинали дифференцироваться в нейроны, а кардиомиоциты получались при добавлении диметилсульфоксида (ДМСО), который обеспечивает направленную доставку гидрофобных сигнальных молекул в клеточное ядро. При этом накопление в культуральной среде активных форм кислорода, а также электрическая стимуляция способствовали формированию зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

Огромные силы и средства были затрачены на поиск условий для дифференцировки ЭСК в инсулинпродуцирующие клетки поджелудочной железы. Однако скоро стало ясно, что целый ряд специализированных линий клеток β-клетки поджелудочной железы, клетки иммунной и эндокринной систем, адипоциты) не возникают из ЭСК при их стимуляции по принципу “один стимулирующий фактор - одна линия клеток”. Этот принцип оказался справедливым только для ограниченного числа клеточных линий. В частности, образование нейронов можно индуцировать ретиноевой кислотой, клеток мышечной линии - трансформирующим фактором роста-β (ТСР-β), эритроидных линий - 1L-6, моноцитарно-миелоидной линии - 1L-3. Причем эффекты этих факторов на дифференцировку ЭСК оказались строго дозозависимыми.

Начался этап поиска комбинаций ростовых факторов, которые продвигали бы ЭСК на более поздние этапы эмбриогенеза с образованием мезодермы (источник кардиомиоцитов, скелетных мышц, эпителия почечных канальцев, миелоэритропоэза и гладкомышечных клеток), эктодермы (эпидермис, нейроны, сетчатка) и энтодермы (эпителий тонкого кишечника и секреторных желез, пневмоциты). Природа как бы заставляла исследователей двигаться вперед по пути эмбриогенеза, повторять его этапы в чашке Петри, не давая возможности сразу и легко получить желаемый результат. И такие комбинации факторов роста были найдены. Активин А в комплексе с ТGF-β оказался мощным стимулятором образования из ЭСК мезодермальных клеток, блокируя при этом развитие энто- и эктодермы. Ретиноевая кислота и а также комбинация сигналов морфогенетического белка костного мозга (ВМР-4) и эпидермального фактора роста (EGF) активируют процессы образования клеток экто- и мезодермы, останавливая развитие энтодермы. Интенсивный рост клеток всех трех зародышевых листков наблюдается при одновременном воздействии на ЭСК двух факторов - фактора роста гепатоцитов (НGF) и фактора роста нервных клеток.

Таким образом, для получения нужных клеточных линий следует сначала переводить эмбриональные стволовые клетки на этап образования клеток какого-либо зародышевого листка, а затем подбирать новую комбинацию ростовых факторов, способную индуцировать направленную дифференцировку экто-, мезо- и эндодермы в специализированные клетки, необходимые для трансплантации больному. Количество комбинаций ростовых факторов на сегодня исчисляется тысячами, большинство из них запатентованы, некоторые вообще не разглашаются биотехнологическими фирмами.

Наступила очередь этапа очистки полученных клеток от недифференцированных клеточных примесей. Дифференцированные в культуре клетки метились маркерами зрелых клеточных линий и пропускались через высокоскоростной лазерный иммунофенотипический сортер. Лазерный луч находил их в общем клеточном потоке и направлял по отдельному пути. Полученный очищенный клеточный материал первыми получили лабораторные животные. Пришло время оценки эффективности применения производных ЭСК на моделях болезней и патологических процессов. Одной из таких моделей была экспериментальная болезнь Паркинсона, которая хорошо воспроизводится на животных с помощью химических соединений, разрушающих дофаминергические нейроны. Поскольку в основе заболевания у человека лежит приобретенный дефицит дофаминергических нейронов, применение заместительной клеточной терапии в данном случае было патогенетически оправданным. У животных с экспериментальным гемипаркинсонизмом приживалось около половины дофаминергических нейронов, полученных из ЭСК и введенных в структуры мозга. Этого оказалось достаточно для значительного уменьшения клинических проявлений заболевания. Вполне успешными оказались попытки восстановления функции поврежденных структур ЦНС при экспериментальных инсульте, травмах и даже разрывах спинного мозга.

Однако следует обратить внимание на то, что практически все случаи успешного применения дифференцированных производных ЭСК для коррекции экспериментальной патологии предпринимались в остром периоде моделируемой патологической ситуации. Отдаленные результаты лечения не были столь утешительны: через 8-16 месяцев позитивный эффект клеточной трансплантации исчезал или резко уменьшался. Причины этого вполне понятны. Дифференцировка трансплантированных клеток in vitro или in loco morbi неизбежно приводит к экспрессии клеточных маркеров генетической чужеродности, что провоцирует иммунную атаку со стороны организма реципиента. Для разрешения проблемы иммунологической несовместимости использовалась традиционная иммуносупрессия, параллельно которой начались клинические испытания по реализации потенциала трансдифференцировки и генетической коррекции не вызывающих иммунного конфликта аутологических гемопоэтических и мезенхимальних стволовых клеток.

Что такое регенеративно-пластическая медицина?

Эволюция определила два основных варианта завершения жизни клетки - некроз и апоптоз, которым на тканевом уровне соответствуют процессы пролиферации и регенерации. Пролиферацию можно рассматривать как своеобразную жертву, когда заполнение дефекта поврежденной ткани происходит за счет его замещения соединительнотканными элементами: сохраняя структурную целостность, организм частично утрачивает функцию пораженного органа, что определяет последующее развитие компенсаторных реакций с гипертрофией или гиперплазией структурно-функциональных элементов, оставшихся не поврежденными. Продолжительность периода компенсации зависит от объема структурных поражений, вызванных факторами первичной и вторичной альтерации, после чего в подавляющем большинстве случаев наступает декомпенсация, резкое ухудшение качества и сокращение продолжительности жизни человека. Регенерация физиологическая обеспечивает процессы ремоделирования, то есть, замену стареющих и погибающих по механизмам естественной клеточной смерти (апоптоза) клеток на новые, происходящие из стволовых клеточных резервов организма человека. В процессах репаративной регенерации также задействованы клеточные ресурсы стволовых пространств, которые, однако, мобилизуются в условиях патологических, связанных с заболеванием или повреждением тканей, инициирующих гибель клеток по механизмам некроза.

Пристальное внимание ученых, врачей, прессы, телевидения и общественности к проблеме изучения биологии эмбриональной стволовой клетки (ЭСК) обусловлены, прежде всего, высокими потенциальными возможностями клеточной или, как называем ее мы, регенеративно-пластической терапии. В основу разработки методов лечения тяжелейших заболеваний человека (дегенеративная патология центральной нервной системы, травмы спинного и головного мозга, болезни Альцгеймера и Паркинсона, рассеянный склероз, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия, сахарный диабет, аутоиммунные заболевания и лейкозы, ожоговая болезнь и неопластические процессы составляют далеко не полный их список) заложены уникальные свойства стволовых клеток, позволяющие создавать новые ткани взамен, как ранее считалось, необратимо поврежденных тканевых зон больного организма.

Прогресс теоретических исследований биологии стволовой клетки за последние 10 лет реализовался спонтанно возникающими направлениями зарождающейся регенеративно-пластической медицины, методология которой уже не только вполне поддается систематизации, но и нуждается в таковой. Первым и наиболее стремительно развивающимся направлением практического использования регенеративного потенциала стволовых клеток стала заместительная регенеративно-пластическая терапия. Ее путь достаточно легко прослеживается в научной литературе - от экспериментов на животных с некрозом миокарда до работ последних лет, направленных на восстановление постинфарктного дефицита кардиомиоцитов или же на восполнение потерь β-клеток поджелудочной железы и дофаминергических нейронов ЦНС.

Клеточная трансплантация

Основой заместительной регенеративно-пластической медицины является клеточная трансплантация. Последнюю следует определить как комплекс медицинских мероприятий, при котором на протяжении короткого или длительного времени организм пациента имеет непосредственный контакт с жизнеспособными клетками ауто-, алло-, изо- или ксеногенного происхождения. Средством клеточной трансплантации является суспензия стволовых клеток или их производных, стандартизированная по количеству трансплантационных единиц. Трансплантационная единица - отношение количества колониеобразующих единиц в культуре к общему количеству трансплантируемых клеток. Методы проведения клеточной трансплантации: внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное введение суспензии стволовых клеток или их производных; введение суспензии стволовых клеток или их производных в желудочки мозга, лимфатические сосуды или спинномозговую жидкость.

При алло- и аутологической клеточной трансплантации используются два принципиально разных методологических подхода к реализации плюри-, мульти- или полипо- тентного потенциала стволовых клеток - in vivo или in vitro. В первом случае введение стволовых клеток в больной организм проводится без их предварительной дифференцировки, во втором - после размножения в культуре, направленной дифференцировки и очистки от недифференцированных элементов. Среди многочисленных методических приемов заместительной клеточной терапии достаточно четко выделяются три группы методов: замещение клеток костного мозга и крови, замещение клеток органов и мягких тканей, замещение жестких и твердых элементов тела (хрящ, кость, сухожилия, клапаны сердца и сосуды емкостного типа). Последнее направление следует определить как реконструктивно-регенеративную медицину, поскольку потенциал дифференциации стволовых клеток реализуется на матрице - биологически инертной или рассасывающейся конструкции, имеющей форму замещаемого участка тела.

Еще одним способом повышения интенсивности регенерационно-пластических процессов в пораженных тканях является мобилизация собственных стволовых ресурсов организма больного путем использования экзогенных ростовых факторов, таких как гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующие факторы. В этом случае разрыв стромальных связей приводит к увеличению выхода в общий кровоток гемопоэтических стволовых клеток, которые в зоне повреждения тканей обеспечивают процессы регенерации за счет присущей им пластичности.

Таким образом, методы регенеративной медицины направлены на стимуляцию процессов восстановления утраченной функции - либо через мобилизацию собственных стволовых резервов больного организма, либо путем введения аллогенного клеточного материала.

Важный практический результат открытия эмбриональных стволовых клеток - терапевтическое клонирование, основанное на понимании пусковых механизмов эмбриогенеза. Если первоначальным сигналом для начала эмбриогенеза является комплекс пре-мРНК, находящийся в цитоплазме ооцита, то введение ядра любой соматической клетки в энуклеированную яйцеклетку должно запустить программу развития эмбриона. Сегодня нам уже известно, что в реализации программы эмбриогенеза принимают участие около 15 000 генов. Что происходит с ними потом, после рождения, в периодах роста, зрелости и старения? Ответ на этот вопрос дала овечка Долли: они сохраняются. С использованием самых современных методов исследования доказано, что ядра клеток взрослого организма сберегают все коды, необходимые для образования эмбриональных стволовых клеток, зародышевых листков, органогенеза и рестрикционного созревания (выхода в дифференцировку и специализацию) клеточных линий мезенхимального, экто-, эндо- и мезодермального происхождения. Терапевтическое клонирование как направление сформировалось уже на самых ранних этапах развития клеточной трансплантологии и предусматривает возврат тотипотентности собственным соматическим клеткам больного человека для получения генетически идентичного трансплантационного материала.

Открытие стволовых клеток началось “с конца”, поскольку термин, введенный в биологию и медицину А. Максимовым, относился к стволовым клеткам костного мозга, которые дают начало всем зрелым клеточным элементам периферической крови. Однако у гемопоэтических стволовых клеток, как и у клеток всех тканей взрослого организма, тоже имеется свой, менее дифференцированный предшественник. Общим же источником для абсолютно всех соматических клеток является эмбриональная стволовая клетка. Следует заметить, что понятия “эмбриональные стволовые клетки” и “стволовые клетки эмбриона” отнюдь не тождественны. Эмбриональные стволовые клетки были выделены Дж. Томсоном из внутренней клеточной массы бластоцисты и переведены в долгоживущие клеточные линии. Только эти клетки имеют факсимиле “ЭСК”. Лерой Стивенс, открывший эмбриональные стволовые клетки в экспериментах на мышах, назвал их “эмбриональными плюрипотентными стволовыми клетками”, имея в виду способность ЭСК дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков (экто-, мезо- и энтодермы). Но при этом все клетки эмбриона более поздних стадий развития тоже являются стволовыми, поскольку дают начало огромному числу клеток, формирующих организм взрослого человека. Для их определения мы предлагаем термин “эмбриональные плюрипотентные прогениторные клетки”.

Виды стволовых клеток

В основу современной классификации стволовых клеток положен принцип их разделения по способности (потентности) давать начало клеточным линиям, которая определяется как тоти-, плюри-, мульти-, поли-, би- и унипотентность. Тотипотентностью, то есть, способностью воссоздавать запрограммированный генетически организм в целом, обладают клетки зиготы, бластомеры и эмбриональные стволовые клетки (клетки внутренней массы бластоцисты). Еще одна группа тотипотентных клеток, которые образуются на более поздних сроках развития эмбриона, представлена первичными герменативными клетками эмбриональной половой зоны (половых бугорков). Плюрипотентность, под которой подимают способность дифференцироваться в клетки любого органа или ткани, присуща эмбриональным клеткам трех зародышевых листков - экто-, мезо- и энтодермы. Считается, что мультипотентность, то есть способность образовывать любые клетки в пределах одной специализированной линии, свойственна лишь двум типам клеток: так называемым мезенхимальным стволовым клеткам, которые образуются в нервном гребне и являются предшественниками всех клеток соединительнотканной основы организма, в том числе и клеток нейроглии, а также гемопоэтическим кроветворным стволовым клеткам, дающим начало всем линиям клеток крови. Кроме того, выделяют би- и унипотентные стволовые клетки, в частности клетки-предшественники миелоидного, лимфоидного, моноцитарного и мегакариоцитарного кроветворных ростков. Существование унипо- тентных стволовых клеток четко доказано на примере клеток печени - утрата значительной части печеночной ткани компенсируется за счет интенсивного деления дифференцированных полиплоидных гепатоцитов.

В процессе развития все органы и ткани формируются в результате пролиферации и дифференциации внутренней клеточной массы бластоцисты, клетки которой и являются, в строгом смысле, тотипотентными эмбриональными стволовыми клетками. Первые работы по выделению эмбриональных стволовых клеток были выполнены Эвансом, показавшим, что бластоцисты, имплантированные в мозг мышей, дают начало тератокарциномам, клетки которых при клонировании формируют линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (первоначальное наименование этих клеток - embryonal carcinoma cells или в аббревиатуре ЕСС - в настоящее время не применяется). Эти данные были подтверждены в ряде других исследований, в которых эмбриональные стволовые клетки получали при культивировании клеток бластоцист мышей и животных иных видов, а также человека.

В литературе последних лет появляется все больше сообщений о пластичности стволовых клеток, которую рассматривают не только как способность последних дифференцироваться в разные типы клеток на разных этапах развития, но и подвергаться дедифференцировке (трансдифференцировке, ретродифференцировке). То есть, допускается принципиальная возможность возвращения соматической дифференцированной клетки на этап эмбрионального развития с рекапитуляцией (возвратом) плюрипотентности и ее реализации в повторную дифференцировку с образованием клеток иного типа. Сообщается, в частности, что гемопоэтические стволовые клетки способны трансдифференцироваться с образованием гепатоцитов, кардиомиобластов и эндотелиоцитов.

Научные дебаты относительно разделения стволовых клеток по их пластичности продолжаются, то есть, терминология и глоссарий клеточной трансплантации находятся в процессе становления, что имеет непосредственное практическое значение, поскольку именно на использовании пластических свойств и способности стволовых клеток к дифференцировке в различные клеточные линии основано большинство методов регенеративнопластической медицины.

Количество публикаций в области фундаментальных и прикладных проблем регенеративно-пластической медицины стремительно возрастает. Уже очерчен круг различных методических подходов, направленных на наиболее оптимальное использование регенеративно-пластического потенциала стволовых клеток. Зоны своих насущных интересов определили кардиологи и эндокринологи, невропатологи и нейрохирурги, трансплантологи и гематологи. В пластических возможностях стволовых клеток ищут решение наболевших проблем офтальмологи, фтизиатры, пульмонологи, нефрологи, онкологи, генетики, педиатры, гастроэнтерологи, терапевты и педиатры, хирурги и акушер-гинекологи - все представители современной медицины надеются получить возможность излечения до сих пор считавшихся фатальными заболеваний.

Является ли клеточная трансплантация очередной “панацеей” от всех бед?

Этот вопрос совершенно справедливо возникает у всех вдумчивых и анализирующих современное состояние медицинской науки врачей и ученых. Ситуация осложняется тем, что на одной стороне поля научного противостояния находятся “здоровые консерваторы”, на другой - “больные фанатики” клеточной трансплантологии. Очевидно, что истина, как всегда, находится между ними - на “ничейной полосе”. Не касаясь пока вопросов права, этики, религии и морали, рассмотрим плюсы и минусы обозначенных направлений регенеративно-пластической медицины. “Легкий ветерок” первых научных сообщений о терапевтических возможностях ЭСК уже через год после их открытия превратился в “шквальный ветер”, закрутившийся в 2003 году в “информационное торнадо”. Первая серия публикаций касалась вопросов культивирования эмбриональных стволовых клеток, их размножения и направленной дифференцировки in vitro.

Выяснилось, что для неограниченного размножения эмбриональных стволовых клеток в культуре необходимо строго соблюдать целый ряд условий. В кондиционной среде обязательно должны присутствовать три фактора: интерлейкин-6 (IL-6), фактор стволовых клеток (SCF) и лейкозингибирующий фактор (LIF). Кроме того, эмбриональные стволовые клетки должны выращиваться на подложке (фидерном слое клеток) из эмбриональных фибробластов и в присутствии фетальной телячьей сыворотки. При соблюдении этих условий ЭСК в культуре растут клонами и образуют эмбриоидные тельца - агрегаты суспензионных клонов шаровидных клеток. Важнейшей особенностью клона ЭСК является то, что в культуре эмбриоидное тельце прекращает рост при накоплении в агрегате 50-60, максимум 100 клеток. В этот период наступает равновесное состояние - скорость деления клеток внутри клона равна скорости апоптоза (программируемой клеточной гибели) на его периферии. После достижения такого динамического равновесия периферические клетки эмбриоидного тельца подвергаются спонтанной дифференцировке (обычно с образованием энтодермальных фрагментов желточного мешка, ангиобластов и эндотелиоцитов) с утратой тотипотентности. Поэтому для получения достаточного количества тотипотентной клеточной массы эмбриональное тельце необходимо дезагрегировать еженедельно с пересадкой единичных эмбриональных стволовых клеток на новую питательную среду - процесс достаточно трудоемкий.

Открытие эмбриональных стволовых клеток не дало ответа на вопрос о том, что именно и как именно запускает программы эмбриогенеза, зашифрованные в ДНК зиготы. Остается неясным, как разворачивается программа генома в процессе жизни человека. Вместе с тем, изучение эмбриональных стволовых клеток позволило разработать концепцию о механизмах сохранения тоти-, плюри- и мультипотентности стволовых клеток в процессе их деления. Главной отличительной чертой стволовой клетки является ее способность к самовоспроизводству. Это означает, что стволовая клетка, в отличие от дифференцированной, делится асимметрично: одна из дочерних клеток дает начало специализированной клеточной линии, а вторая сохраняет тоти-, плюри- или мультипотентность генома. Оставалось непонятным, почему и как этот процесс происходит на самых ранних стадиях эмбриогенеза, когда делящаяся внутренняя клеточная масса бла-стоцисты вся является тотипотентной, а геном ЭСК находится в дормантном (спящем, заторможенном) состоянии. Если при делении обычной клетки процессу дупликации обязательно предшествует активация и экспрессия целого комплекса генов, то при делении ЭСК этого не происходит. Ответ на вопрос “почему” был получен после открытия в ЭСК предсуществующих мРНК (пре-мРНК), часть которых образуется еще в фолликулярных клетках и сохраняется в цитоплазме яйцеклетки и зиготы. Второе открытие ответило на вопрос “как”: в ЭСК были обнаружены особые ферменты, получившие название “эдитазы”. Эдитазы выполняют три важнейшие функции. Во-первых, они обеспечивают альтернативное эпигенетическое (без участия генома) считывание и дупликацию пре-мРНК. Во-вторых, реализуют процесс активации пре-мРНК (сплайсинг - вырезание интронов, то есть, неактивных участков РНК, тормозящих процесс синтеза белка на мРНК), после чего в клетке начинается сборка белковых молекул. В-третьих, эдитазы способствуют образованию вторичных мРНК, являющихся репрессорами механизмов генной экспрессии, что сохраняет плотную упаковку хроматина и неактивное состояние генов. Белковые продукты, синтезированные на таких вторичных мРНК и получившие название белков-сайленсеров или хранителей генома, присутствуют в яйцеклетках человека.

Именно так на сегодня представляется механизм образования бессмертных клеточных линий эмбриональных стволовых клеток. Проще говоря, сигнал к запуску программы эмбриогенеза, начальные этапы которого заключаются в образовании тотипотентной клеточной массы, поступает из цитоплазмы яйцеклетки. Если на этом этапе внутренняя клеточная масса бластоцисты, то есть ЭСК, будет изолирована от дальнейших регуляторных сигналов, процесс самовоспроизводства клеток происходит по замкнутому циклу без участия генов клеточного ядра (эпигенетически). Если обеспечить такую клетку питательным материалом и изолировать от внешних сигналов, способствующих дифференцировке клеточной массы, она будет делиться и воспроизводить себе подобных бесконечно.

Первые результаты экспериментальных попыток использования тотипотентных клеток для трансплантации оказались весьма впечатляющими: введение эмбриональных стволовых клеток в ткани мышей с ослабленной иммунодепрессорами иммунной системой в 100% случаев приводило к развитию опухолей. Среди клеток неоплазмы, источником которой были ЭСК, встречались дифференцированные производные тотипотентного экзогенного клеточного материала, в частности нейроны, однако рост тератокарцином сводил ценность полученных результатов на нет. В то же время, в работах Л. Стивенса, ЭСК, введенные в брюшную полость, формировали крупные агрегаты, в которых фрагментарно образовывались эмбриональные мышцы, сердце, волосы, кожа, кости, мышцы и нервная ткань. (Хирургам, вскрывавшим дермоидные кисты, эта картина должна быть знакома). Интересно, что суспензированные клетки мышиного эмбриобласта ведут себя точно так же: их введение в ткани взрослых иммуноскомпрометированных животных всегда вызывает образование тератокарцином. Но если из такой опухоли выделить чистую линию ЭСК и ввести ее в брюшную полость, то опять-таки образуются специализированные соматические дериваты всех трех зародышевых листков без признаков канцерогенеза.

Таким образом, следующая проблема, которую необходимо было решить, заключалась в очистке клеточного материала от примесей недифференцированных клеток. Однако даже при очень высокой эффективности направленной клеточной дифференцировки до 20% клеток в культуре сохраняют свой тотипотентный потенциал, который in vivo, к сожалению, реализуется в опухолевый рост. Еще одна “рогатка’ природы - на чаше весов врачебного риска гарантия выздоровления больного балансирует с гарантией его смерти.

Взаимоотношения опухолевых клеток и более продвинутых в развитии, чем ЭСК, эмбриональных плюрипотентных прогениторных клеток (ЭППК) весьма неоднозначны. Результаты наших исследований показали, что введение ЭППК в различные перевиваемые опухоли у крыс может приводить к распаду опухолевой ткани (Г), быстрому увеличению массы опухоли (Д), ее редукции (Е-3) или же никак не влияет на размеры спонтанного центрального очагового некроза неопластической ткани (И,К). Очевидно, что результат взаимодействия ЭППК и опухолевых клеток определяется общей совокупностью цитокинов и факторов роста, продуцируемых ими in vivo.

Примечательно, что эмбриональная стволовая клетка, отвечая канцерогенезом на контакт с тканями взрослого организма, прекрасно ассимилируются с клеточной массой эмбриона, встраиваясь во все органы зародыша. Такие химеры, состоящие из собственных клеток эмбриона и донорских ЭСК, получили название аллофенных животных, хотя, по сути, фенотипическими химерами они не являются. Максимальной клеточной химеризации при введении ЭСК в ранний эмбрион подвергается кроветворная система, кожа, нервная ткань, печень и тонкая кишка. Описаны случаи химеризации половых органов. Единственной неприкосновенной для ЭСК зоной оказались первичные половые клетки.

То есть, эмбрион сохраняет генетическую информацию своих родителей, что оберегает чистоту и продолжение как рода, так и вида.

В условиях блокады деления клеток раннего эмбриона с помощью цитоклазина введение эмбриональных стволовых клеток в бластоцисту приводит к развитию зародыша, у которого первичные половые клетки, как и все другие, образовались из донорских эмбриональных стволовых клеток. Но в этом случае и сам эмбрион полностью является донорским, генетически чужим для организма суррогатной матери. Механизмы такого природного блока потенциальной возможности смешивания собственной и чужеродной наследственной информации пока не выяснены. Можно предположить, что в этом случае реализуется программа апоптоза, детерминанты которой нам еще не известны.

Следует обратить внимание на то, что эмбриогенез животных разных видов никогда не согласовывается: при реализации донорской программы органогенеза в организме зародыша-реципиента ксеногенных эмбриональных стволовых клеток эмбрион погибает внутриутробно и резорбируется. Поэтому существование химер “крыса-мышь", “свинья-корова", “человек-крыса" нужно понимать как клеточный, но не морфологический мозаицизм. Иными словами, при введении ЭСК одного вида млекопитающих в бластоцисту другого вида всегда развивается потомство материнской видовой принадлежности, у которого среди собственных клеток практически всех органов обнаруживаются включения, а иногда и скопления структурно-функциональных единиц, состоящих из генетически чужеродного материала производных ЭСК. Нельзя воспринимать термин “гуманизированная свинья" как обозначение некоего монстра, наделенного разумом или внешними признаками человека. Это всего лишь животное, часть клеток организма которого происходит из введенных в бластоцисту свиньи ЭСК человека.

Перспектива применения стволовых клеток

Давно известно, что заболевания, связанные с генопатологией клеток кроветворной и лимфоидной линий, нередко устраняются после аллогенной трансплантации костного мозга. Замена собственной кроветворной ткани на генетически нормальные клетки родственного донора приводит к частичному, а иногда и полному выздоровлению пациента. Среди генетических заболеваний, которые лечатся с помощью аллогенной пересадки костного мозга, следует отметить синдром комбинированного иммунодефицита, Х-связанную агаммаглобулинемию, хронический гранулематоз, синдром Вискотта-Олдрича, болезни Гоше и Харлера, адренолейкодистрофию, метахроматическую лейкодистрофию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, анемию Фанкони и СПИД. Основная проблема в использовании аллогенной трансплантации костного мозга при лечении этих заболеваний связана с подбором НbА-совместимого родственного донора, для успешного поиска которого в среднем необходимо 100 000 образцов типированной донорской гемопоэтической ткани.

Генотерапия позволяет корректировать генетический дефект непосредственно в стволовых кроветворных клетках пациента. Теоретически генотерапия предоставляет те же преимущества в лечении генетических заболеваний системы кроветворения, что и аллогенная трансплантация костного мозга, но без всех возможных иммунологических осложнений. Однако для этого нужна техника, позволяющая эффективно переносить полноценный ген в стволовые кроветворные клетки и поддерживать необходимый уровень его экспрессии, который при определенных видах наследственной патологии может быть и не очень высоким. В этом случае даже незначительное восполнение белкового продукта дефицитного гена дает позитивный клинический эффект. В частности, при гемофилии В для восстановления внутреннего механизма свертывания крови вполне достаточно 10-20% нормального уровня фактора IX. Генетическая модификация аутологического клеточного материала оказалась успешной при экспериментальном гемипаркинсонизме (одностороннее разрушение дофаминергических нейронов). Трансфекция эмбриональных фибробластов крысы ретровирусным вектором, содержащим ген тирозингидроксилазы, обеспечила синтез дофамина в ЦНС: интрацеребральное введение трансфецированных фибробластов резко снижало интенсивность клинических проявлений экспериментальной модели болезни Паркинсона у подопытных животных.

Перспектива применения стволовых клеток для генотерапии болезней человека поставила множество новых задач перед клиницистами и экспериментаторами. Проблемные аспекты генотерапии связаны с разработкой безопасной и эффективной системы транспорта гена в клетку-мишень. В настоящий момент эффективность переноса генов в клетки крупных млекопитающих очень мала (1%). Методически эта проблема решается различными способами. Перенос гена in vitro заключается в трансфекции генетического материала в клетки пациента, находящиеся в культуре, с последующим возвратом их в организм больного. Этот подход следует признать оптимальным при использовании генов, введенных в стволовые клетки костного мозга, поскольку методы переноса кроветворных клеток из организма в культуру и обратно достаточно хорошо отработаны. Чаще всего для переноса гена в гемопоэтические клетки in vitro используются ретрови-русы. Однако основная масса стволовых кроветворных клеток находится в состоянии покоя, что затрудняет транспорт генетической информации с помощью ретровирусов и требует поиска новых путей эффективного транспорта генов в дормантные стволовые клетки. В настоящее время используются такие методы переноса генов, как трансфекция, прямая микроинъекция ДНК в клетки, липофекция, электропорация, “генное ружье”, механическое соединение с помощью стеклянных бус, трансфецирование гепатоцитов рецепторзависимым соединением ДНК с асиалогликопротеином, а также аэрозольное введение трансгена в клетки альвеолярного эпителия легких. Эффективность переноса ДНК этими методами составляет 10,0-0,01%. Другими cловами, в зависимости от метода введения генетической информации, успеха можно ожидать у 10 больных из 100 или у 1 больного из 10 ООО пациентов. Очевидно, что эффективный и в то же время безопасный метод переноса терапевтических генов еще только предстоит разработать.

Принципиально иным решением проблемы отторжения аллогенного клеточного материала в клеточной трансплантологии является использование высоких доз эмбриональных плюрипотентных прогениторных клеток для достижения эффекта переинсталляции системы контроля антигенного гомеостаза взрослого организма (эффект Кухарчука-Радченко-Сирмана), сущность которого заключается в индукции иммунологической толерантности путем создания новой базы иммунокомпетентных клеток при одновременном перепрограммировании системы контроля антигенного гомеостаза. После введения больших доз ЭППК последние фиксируются в тканях тимуса и костного мозга. В тимусе ЭППК под влиянием специфического микроокружения дифференцируются в дендритные, интердигитатные клетки и эпителиально-стромальные элементы. В процессе дифференцировки ЭППК в тимусе реципиента, наряду с собственными молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), экспрессируются молекулы МНС, которые генетически детерминированы в донорских клетках, то есть, устанавливается двойной стандарт молекул МНС, по которому реализуется позитивная и негативная селекция Т-лимфоцитов.

Таким образом, обновление эффекторного звена иммунной системы организма реципиента происходит по известным механизмам позитивной и негативной селекции Т-лимфоцитов, но через двойной стандарт молекул МНС - реципиента и донорских ЭППК.

Перепрограммирование иммунной системы с помощью ЭППК не только позволяет проводить клеточную трансплантацию без последующего продолжительного применения иммунодепрессантов, но и открывает совершенно новые перспективы в лечении аутоиммунных заболеваний, а также дает точку опоры для развития новых представлений о процессе старения человека. Для понимания механизмов старения нами предложена теория истощения стволовых пространств организма. Согласно основному положению данной теории, старение представляет собой перманентное сокращение размеров стволовых пространств организма, под которыми понимается пул регионарных (“взрослых”) стволовых клеток (мезенхимальные, нейрональные, гемопоэтические стволовые клетки, прогениторные клетки кожи, пищеварительного тракта, эндокринного эпителия, пигментные клетки цилиарных складок и др.), восполняющий клеточные потери соответствующей ткани в процессе ремоделирования организма. Ремоделирование организма - это обновление клеточного состава всех тканей и органов за счет клеток стволовых пространств, которое продолжается на протяжении всей жизни многоклеточного организма. Количество клеток в стволовых про странствах детерминировано генетически, что определяет ограниченность размеров (пролиферативного потенциала) каждого стволового пространства. В свою очередь, размеры стволовых пространств определяют скорость старения отдельных органов, тканей и систем организма. После истощения клеточных резервов стволовых пространств интенсивность и скорость старения многоклеточного организма определяется механизмами старения соматических дифференцированных клеток в пределах лимита Хейфлика.

Следовательно, на этапе постнатального онтогенеза расширение стволовых пространств может не только значительно увеличить продолжительность, но и улучшить качество жизни за счет восстановления потенциала ремоделирования организма. Достигнуть расширения стволовых пространств можно путем введения больших доз аллогенных эмбриональных плюрипотентных прогениторных клеток при условии одновременного перепрограммирования иммунной системы реципиента, что в эксперименте существенно увеличивает продолжительность жизни старых мышей. 

Теория истощения стволовых пространств способна изменить существующие представления не только о механизмах старения, но и о болезни, а также о последствиях ее медикамемтозного лечения. В частности, болезнь может развиваться как результат патологии клеток стволовых пространств (онкопатология). Истощение резерва мезенхимальных стволовых клеток нарушает процессы ремоделирования соединительной ткани, что приводит к появлению внешних признаков старости (морщины, дряблость кожи, целлюлит). Истощение стволового резерва эндотелиальных клеток вызывает развитие артериальной гипертензии и атеросклероза. Изначально малые размеры стволового пространства тимуса определяют его раннюю перманентную возрастную инволюцию. Преждевременное старение является следствием изначального патологического уменьшения размеров всех стволовых пространств организма. Медикаментозная и немедикаментозная стимуляция резервов стволовых клеток повышает качество жизни за счет сокращения ее продолжительности, поскольку уменьшает размеры стволовых пространств. Низкая эффективность современных геропротекторов обусловлена их защитным влиянием на стареющую дифференцированную соматическую клетку, а не на стволовые пространства организма.

В заключение еще раз отметим, что регенеративно-пластическая медицина - новое направление в лечении болезней человека, основанное на использовании регенеративно-пластического потенциала стволовых клеток. При этом под пластичностью понимается способность экзо- или эндогенных стволовых клеток имплантироваться и давать начало новым специализированным клеточным росткам в поврежденных тканевых зонах больного организма. Объект регенеративно-пластической медицины - неизлечимые до настоящего времени смертельные заболевания человека, наследственная патология, болезни, при которых методами традиционной медицины достигается только симптоматический эффект, а также анатомические дефекты тела, на восстановление которых направлена реконструктивнопластическая регенеративная хирургия. Первые попытки воссоздания цельных и при этом функционально полноценных органов из стволовых клеток, на наш взгляд, еще рано выносить в отдельную область практической медицины. Субъектом регенеративно-пластической медицины являются стволовые клетки, имеющие, в зависимости от источника их получения, различный регенеративно-пластический потенциал. Методология регенеративно-пластической медицины основана на трансплантации стволовых клеток или их производных.

!
Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.

Медицинский эксперт-редактор

Портнов Алексей Александрович

Образование: Киевский Национальный Медицинский Университет им. А.А. Богомольца, специальность - "Лечебное дело"

Другие врачи





Новейшие исследования по теме Стволовые клетки и регенеративно-пластическая медицина

Рак – самая распространенная в мире причина смерти, от него ежегодно умирают более семи миллионов человек. Раковая опухоль может поразить любую часть тела, а шансы на выживание могут быть различными в зависимости от вида рака и того, где живет...

Лечение стволовыми клетками помогает установить контроль над мочеиспусканием и устранить посттравматические боли после повреждения спинного мозга у подопытных грызунов.

Поделись в социальных сетях

Сообщите нам об ошибке в этом тексте:
Просто нажмите кнопку "Отправить отчет" для отправки нам уведомления. Так же Вы можете добавить комментарий.