Причины туберкулеза

Таксономия микобактерий

Все микобактерии разделяют на патогенные для человека и условно-патогенные.

В клинической микробиологии используют несколько подходов для классификации микобактерий:

• по скорости и оптимальной температуре роста, способности к образованию пигмента;
• по клинически значимым комплексам.

Вызывающие туберкулёз виды микобактерий объединены в комплекс М. tuberculosis, включающий М. tuberculosis, М. bovis. М. bovis BCG, М. africanum, М. microti, М. canettii. В последнее время к нему отнесены М. pinnipedii, М. саргае, филогенетически имеющие отношение к М. microti и М. bovis.

Остальные микобактерии, вызывающие различные микобактериозы, отнесены к группе нетуберкулёзных микобактерий. Из этой группы выделяют следующие комплексы: М. avium, состоящий из М. avium, М. intracellulare, М. scrofulaceum; M.fortuitum включающий подвиды M.fortuitum и М. chelonae, и М. terrae, включающий М. terrae, М. triviale и М. nonchromogenicum. Важнейшие группы составляют возбудители проказы М. leprae, а также возбудители язвенных поражений Buruli М. ulcerans.

Такая классификация объединяет виды микобактерий с одинаковой клинической значимостью, когда более тонкая их дифференциация несущественна. Для идентификации видов внутри групп и комплексов используют биологические, биохимические и молекулярные методы.

Классификация нетуберкулёзных микобактерий на основе культуральных различий была разработана Раньоном в 1959 г. Согласно ей. выделяют 4 группы микобактерий.

Группа I - фотохромогенные микобактерии

К этой группе относят микобактерии, не пигментированные при выращивании о темноте, но приобретающие ярко-жёлтую или жёлто-оранжевую пигментацию после выдерживания на свету. Потенциально патогенные штаммы, относящиеся к этой группе. - М. asiaticum, М. kansasii, М. marinum, М. simiae. Среди микобактерий этой группы есть как быстрорастущие (М. marinum), так и медленно растущие (М. asiaticum, М. kansasii). Оптимальная температура роста варьирует от 25 ^оС для М. simiae, 32-33 ^оС для М. marinum до 37 ^оС для М. asiaticum.

Наибольшую клиническую значимость в нашей стране имеет вид М. kansasii, встречающийся в водоёмах. Штамм М. kansasii (М. luciflavum) вызывает заболевания у людей. На яичной среде растёт в виде шероховатых или гладких колоний, температурный оптимум 37 ^оС. Морфологически бактерии умеренной длины. На сегодняшний день описаны 2 варианта М. kansasii: оранжевый и белый. При введении морским свинкам М. kansasii вызывают инфильтраты и уплотнение региональных лимфатических узлов.

Группа II - скотохромогенные микобактерии (от греческого слова scotos - темнота)

К этой группе относят микобактерии, образующие пигмент в темноте. Скорость роста 30-60 дней. В эту группу входят М. aquae (М. gordonae) и М. scrofulaceum.

М. scrofulaceum относят к потенциально патогенным видам. На яичной среде бактерии этого вида растут в виде гладких или шероховатых колоний оранжевого цвета. Морфологически микобактерии имеют палочковидную форму, короткие или длинные. Растут при температуре 25-37 ^оС. У детей вызывают поражение лимфатических узлов и легких.

М. aquae (М. gordonae) относят к сапрофитным скотохромогенным микобактериям. На яичной среде растут в виде оранжевых колоний при температуре 25-37 °С. Морфологически микобактерии палочковидной формы и умеренной длины (>5 мкм). Обнаружены в водоёмах.

Группа III - нефотохромогенные микобактерии

К этой группе относят микобактерии, не образующие пигмент или имеющие бледно-жёлтую окраску, которая не усиливается на свету. Растут в течение 2-3 или 5-6 нед. К ним относят. М. avium, М. intracellulare, М. xenopi, М terrae, М. gastri, М. hattey, М. bruiiense.

М. avium (микобактерии птичьего типа) растут на среде Левенштейна-Йенсена в виде пигментированных или слабопигментированных колоний при 37 ^оС и 45 ^оС. Морфологически - это палочки, имеющие среднюю длину. Они могут быть патогенны для человека и ряда лабораторных, а также домашних животных (например, свиней). Обнаружены в воде и почве.

М. xenopi выделена от жабы. Молодые культуры растут в виде непигментированных колоний. Позднее появляется пигмент жёлтого цвета. Морфологически - длинные нитевидные палочки. Растут при температуре 40-45 ^оС. Условно патогенны для человека.

М. terrae впервые были выделены из редьки. Растут на среде Левенштейна-Йенсена и виде беспигментных колоний. Оптимум роста 37 ^оС. Морфологически представлены палочками умеренной длины, сапрофиты.

Группа IV - быстрорастущие микобактерии

Микобактерии, относящиеся к этой группе, характеризуются быстрым ростом (до 7-10 дней). Растут в виде пигментных или беспигментных колоний, чаще в виде R-формы. Хороший рост дают в течение 2-5 дней при температуре 25 ^оС. К этой группе относят потенциально патогенные микобактерии M.fortuitum, а также сапрофитные микобактерии, такие, как М. phlei, М. smegmatis и др. M. fortuitum даёт видимый рост на яичной среде на 2-4-й день в виде «розетки». Морфологически микобактерии представлены короткими палочками. На среде Левенштейна-Йенсена могут поглощать малахитовую зелень и окрашиваться в зелёный цвет. Широко распространены в природе.

Классификация по Раньону оказалась весьма удобной для проведения идентификации наиболее часто встречаемых видов микобактерий. Однако выявление новых видов и появление всё большего числа промежуточных форм микобактерий вызывает затруднения в их регистрации в той или иной группе Раньона.

М. tuberculosis - молодое эволюционное образование. В последнее время прослеживается тенденция к разделению М. tuberculosis на кластеры или семейства. Наиболее важными можно считать штаммы, относящиеся к семейству Beijing, отличающиеся клональным поведением и способностью вызывать микровспышки туберкулёза.

Морфология микобактерий

Микобактерии - тонкие палочковидные клетки с характерным свойством кислото- и спиртоустойчивости (на одной из стадий роста), аэробные. При окраске по Граму слабо грамположительны. Микобактерии неподвижны, спор не образуют. Конидии или капсулы отсутствуют. Растут на плотных питательных средах медленно или очень медленно: при оптимальной температуре видимые колонии появляются через 2-60 сут. Колонии розовые, оранжевые или жёлтые, особенно при росте на свету. Пигмент не диффундирует. Поверхность колоний обычно матовая (S-тип) или шероховатая (R-тип). Нередко микобактерии растут в виде слизистых или морщинистых колоний. На жидких средах микобактерии растут на поверхности. Нежная сухая плёнка со временем утолщается, становится бугристо-морщинистой и обретает желтоватый оттенок. Бульон остаётся прозрачным и добиться диффузного роста удаётся в присутствии детергентов. В микроколониях М. tuberculosis (т.е. на ранних сроках) образуются структуры, напоминающие жгуты - признак, который связывают с корд-фактором.

При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулёза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул.

Длина микобактерий составляет примерно 1-10мкм. а ширина - 0.2-0.7 мкм. Иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. Микроорганизмы, располагающиеся поодиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры «V».

В препарате можно выявить также изменённые кокковидные кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или мицелиеподобные структуры. В этом случае положительный ответ должен быть подтверждён дополнительными методами.

Строение клеточной стенки микобактерий

Клеточная стенка микобактерий - самая сложная по сравнению с остальными прокариотами.

В то время как грамотрицательные бактерии имеют две мембраны, клеточная стенка микобактерий состоит из нескольких слоев, часть из которых содержит сахара и характеризуется относительно постоянным составом. Наружные слои имеют меняющийся химический состав и в основном представлены липидами, большинство из которых - миколовые кислоты и их производные. Как правило, эти слои не видны при электронной микроскопии. Первичным каркасом клеточной стенки служат перекрёстно связанные пептидогликаны - электронноплотный слой. Слой арабиногалактанов повторяет слой пептидогликанов, образуя полисахаридную строму клеточной стенки. Он имеет точки связи с пептидогликановым слоем и структуры для крепления миколовых кислот и их производных.

Миколовые кислоты присутствуют в виде свободных сульфолипидов и корд-фактора, с наличием которого на поверхности клеток связано характерное образование колоний М . tuberculosis в виде жгутов. Уникальность и ключевая роль миколовых кислот в структурной организации и физиологии микобактерий делают их отличной мишенью для этиотропной терапии.

Слой гликолипидов называют «микозидами» и иногда сравнивают с микрокапсулой. Микозиды структурно и функций нально напоминают липополисахариды наружной мембраны грамотрицательных бактерий, но лишены их агрессивности, тем не менее они токсичны и (подобно корд-фактору и сульфолипидам) вызывают образование гранулём.

Клеточная мембрана и слои клеточной оболочки пронизаны каналами или порами, среди которых можно выделить пассивные поры с малым временем жизни, обеспечивающие управляемую диффузию веществ, и каналы с более длительным временем жизни, обеспечивающие энергозависимый транспорт веществ.

Ещё одним компонентом клеточной стенки микобактерий является липоарабиноманнан. Он заякорен на плазматической мембране, пронизывает клеточную стенку и выходит на её поверхность. В этом отношении он похож на липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий или липополисахаридный О-антиген грамотрицательных бактерий. Терминальные фрагменты липоарабиноманнана, прежде всего его маннозные радикалы, неспецифически подавляют активацию Т-лимфоцитов и лейкоцитов периферической крови. Это приводит к нарушению иммунного ответа на микобактерии.

Изменчивость и формы существования микобактерий

Персистенция бактерий имеет особое патогенетическое значение. Лабораторные эксперименты, проводившиеся in vitro и in vivo, показали, что бактерицидные препараты изониазид и пиразинамид убивают микобактерии только в фазе размножения. Если же микобактерии находятся в фазе низкой метаболической активности (т.е. бактериальный рост почти полностью приостановлен и бактерии можно назвать «дремлющими»), бактерицидные препараты на них не действуют. Такое состояние принято называть дормантным, а микроорганизмы - персистерами. Персистеры не чувствительны к химиопрепаратам, т.е. ведут себя как устойчивые микроорганизмы. В действительности они могут сохранять чувствительность к лекарственным средствам.

Мощным стимулом для перехода клеток микобактерий в дормантное состояние являются химиотерапевтические препараты, а также факторы иммунной системы хозяина. Персистеры способны сохраняться в очагах поражения месяцами или даже годами. Во время персистенции микобактерии могут трансформироваться в L-формы. В этом виде микобактерии проявляют крайне низкую метаболическую активность, направленную в первую очередь на увеличение толщины клеточной стенки и внеклеточного матрикса, препятствующего простой диффузии веществ. Кроме того, в микобактериях происходит накопление генетического материала, позволяющего увеличить вероятность воссоздания нормально функционирующей клетки при наступлении благоприятных условий. Выявление L-форм стандартными микробиологическими методами затруднено.

Если дремлющие микобактерии вновь приобретают метаболическую активность и начинают размножаться во время проведения химиотерапии, они быстро погибают. Если же химиотерапия завершена, такие «ожившие» микобактерии продолжают размножаться и вызывают рецидив заболевания. Этим объясняют оправданность длительных курсов химиотерапии и применение последующих коротких профилактических. как правило сезонных, курсов химиопрофилактики.

Физиология микобактерий

В царстве прокариот микобактерии являются несомненными лидерами в области синтеза сложнейших органических соединений. Вероятно, они обладают самым гибким метаболизмом, обеспечивающим необходимую изменчивость для выживания как во внешней среде, так и в макроорганизме. На сегодняшний день описаны более 100 ферментативных реакций, показывающих разветвлённый и сложный характер метаболизма микобактерий. Для синтеза конечных соединений или обеспечения необходимых физиологических функций в микобактериях могут осуществляться параллельные метаболические пути в зависимости от доступности субстрата, химического окружения, обеспеченности дыхательных циклов необходимыми компонентами (ионы металлов, парциальное давление кислорода, углекислого газа и др.).

Биохимические свойства микобактерий

[12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]

Метаболизм липидов

Липиды клеточной стенки, составляющие до 60% сухой массы клетки, определяют нестандартность тинкториальных, физиологических и экологических свойств микобактерий.

Описанные к настоящему времени специфические липиды микобактерий по структурным признакам делят на 7 основных групп:

1. жирнокислотные производные углеводов (главным образом, трегалозы - корд-фактор):
2. маннозиды фосфатидилмиоинозита:
3. жирнокислотные производные пептидов;
4. гликозиды N-ацилпептидов - микозиды С;
5. жирнокислотные эфиры фтиоцеролов;
6. микозиды А, В. G;
7. миколаты глицерина.

Липиды групп 4-6 найдены только в микобактериях.

Среди уникальных следует отметить туберкулостеариновую и туберкулопальмитиновую кислоты, являющиеся предшественниками миколовых кислот.

Миколовые кислоты - группа высокомолекулярных жирных кислот с длиной цепи до 84 углеродных атомов, структура основной цепи которых определяется систематическим положением микроорганизма и условиями его роста. Их низкая реакционная способность обеспечивает высокую химическую устойчивость клеточной стенки микобактерий. Миколаты подавляют ферментное расщепление клеточной стенки и свободнорадикальные реакции.

Корд-фактор относят к 1-й группе липидов. С ним связывают высокую токсичность микобактерий и вирулентность.

Поверхностно-активные липиды, или сульфолипиды, играют важную роль во внутриклеточной адаптации микобактерий. Вместе с корд-фактором они образуют цитотоксические мембранотропные комплексы.

Липоарабиноманнан представляет собой гетерогенную смесь высокомолекулярных липополисахаридов: разветвлённые полимеры арабинозы и маннозы с диацилглицериновыми производными пальмитиновой и туберкулостеариновой кислот.

Микозиды С представляют собой пептидогликолипиды. образующие внешнюю оболочку микобактерий, которую можно наблюдать при электронной микроскопии в виде прозрачной зоны на периферии клеток. Микозиды - видоспецифичные соединения. от их типа зависят антигенные свойства микобактерий.

Количественный и качественный состав липидных соединений микобактерий имеет динамичный характер и зависит от возраста клеток, состава питательных сред, физико-химических характеристик окружающей среды. Молодые клетки микобактерий начинают формировать клеточную стенку с синтеза липополисахаридов с относительно короткими алифатическими цепями. На этой стадии они достаточно уязвимы и доступны для иммунной системы. По мере наращивания клеточной стенки и формирования высокомолекулярных липидов микобактерии приобретают устойчивость и индифферентность во взаимоотношениях с иммунной системой.

Метаболизм углеводов

Наиболее предпочтительным источником углерода для микобактерий является глицерин.

Важнейшие углеводы - арабиноза. манноза и мальтоза - составляют более половины всех сахаридов. Кроме того, в жизнедеятельности клетки играют роль трегалоза, глюкоза, фруктоза, галактоза, рамноза и некоторые другие сахариды. При этом синтез идёт по гидролазному и альдолазному путям. Пируватный путь используется для синтеза гликогена. Арабиноза и манноза участвуют в образовании важных структурный соединений. Для получения энергии используется пентозофосфатный путь окисления глюкозы. Он обеспечивается ферментами малат-, изоцитрат- и сукцинат- дегидрогеназами, что придает гибкость дыхательной системе.

Уникален глиоксилатный путь, который микобактерии используют для вовлечения в цикл трикарбоновых кислот свободных жирных кислот, которые накапливаются в процессе роста микобактерии. Этот цикл привлекает внимание исследователей как возможный механизм хемотаксиса микобактерий во время персистенции.

Метаболизм азота и аминокислот

Скорость утилизации микобактериями нитратов, нитритов, гидроксиламинов может служить для идентификации видов. В качестве источника азота микобактерии предпочитают аспарагин. Синтез аминокислот является энергозависимым процессом и обеспечивается группой ферментов, позволяющих использовать другие аминокислотные соединения, например, глутамат.

Нитрит- и нитратредуктазная активность

Микобактерии туберкулёза могут образовывать аденозинтрифосфат (АТФ) при переносе электронов по цепи переносчиков, оканчивающейся NО₃-, а не О₂ В этих реакция происходит восстановление NО₃ до NH₃ в количествах, которые необходимы для синтезов аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Это осуществляется посредством последовательного действия нитрат- и нитритредуктаз.

Каталазная и пероксидазная активность

Каталаза предотвращает накопление перекиси водорода, которая образуется при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Активность фермента зависит от pH среды и температуры. При температуре 56 °С каталаза не активна. Существуют тесты на принадлежность к патогенному комплексу микобактерий, основанные на термолабильности каталазы.

Известно, что 70% штаммов микобактерий туберкулёза, устойчивых к изониазиду, теряет свою каталазную и пероксидазную активность.

Пероксидазная и каталазная активность осуществляется одним и тем же ферментным комплексом.

[21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]

Витамины и коферменты

В состав М. tuberculosis входят витамины группы В (рибофлавин, пиридоксин. цианокобаламин, тиамин), витамины С и К. парааминобензойная кислота, пантотеновая и никотиновая кислоты, биотин и фолиевая кислота.

Обмен веществ, питание и дыхание микобактерий

В обычных, благоприятных, условиях микобактерии туберкулёза - строгие аэробы и мезофилы, т.е. они растут при наличии кислорода и в диапазоне температур 30-42 ^оС, лучше всего при 37 ^оС. При неблагоприятных внешних условиях и(или) недостаточности кислорода микобактерии туберкулёза проявляют себя как микроаэрофилы и даже как анаэробы. При этом их обмен веществ претерпевает существенные изменения.

По потреблению кислорода и развитости оксидазных систем микобактерии схожи с истинными грибами. В качестве связующего звена между НАДН-дегидрогеназой и цитохромом b в переносящей системе рода Mycobacterium служит витамин К₉. Эта система цитохромов напоминает митохондриальную. Она чувствительна к динитрофенолу, так же как и у высших организмов.

Описанный тип дыхания не единственный источник образования АТФ. Кроме О₂-терминальной. микобактерии могут использовать дыхательные цепи, переносящие электроны и оканчивающиеся нитратами (NО₃^-). Резервом дыхательной системы микобактерий является глиоксилатный цикл.

Бескислородное (эндогенное) дыхание, проявляющееся в атмосфере с концентрацией кислорода менее 1%, стимулируют азидные соединения, которые уменьшают окисление пирувата или трегалозы.

Рост и размножение микобактерий

Микобактерии туберкулёза размножаются крайне медленно: период удвоения 18-24 ч (обычные бактерии делятся каждые 15 мин). Поэтому для получения видимого роста типичных колоний требуется не менее 4-6 нед. Одной из причин медленного размножения микобактерий считают их выраженную гидрофобность которая затрудняет диффузию питательных веществ. Более вероятно, что это генетически детерминировано и связано с более сложным устройством микобактерий. Известно, например, что большинство бактерий имеет множество копий оперона рибосомалыюй рибонуклеиновой кислоты (рРНК). Медленно растущие микобактерии (М. tuberculosis, М. leprae) имеют по одной копии оперона, а быстрорастущие (М. smegmatis) - лишь две копии.

При культивировании на жидких средах микобактерии растут на поверхности. Нежная сухая плёнка со временем утолщается, становится бугристо-морщинистой и обретает желтоватый оттенок, часто сравниваемый с цветом слоновой кости. Бульон остаётся прозрачным, и добиться диффузного роста удаётся только в присутствии детергентов, например твина-80. В микроколониях (т.е. на ранних сроках) образуются структуры, напоминающие жгуты, - признак, который связывают с корд-фактором М. tuberculosis.

Генетика микобактерий

Род микобактерий с генетической точки зрения очень разнообразен. В отличие от многих сапрофитных и нетуберкулёзных микобактерий микобактерии туберкулёза не содержат экстрахромосомных включений (например, плазмид). Всё разнообразие свойств микобактерий туберкулёза определяется её хромосомой.

Геном М. tuberculosis complex чрезвычайно консервативен. Его представители обладают гомологией ДНК на уровне 85-100%. в то время как ДНК других видов микобактерий гомологичны М. tuberculosis лишь на 4-26%.

Представители рода микобактерий имеют по сравнению с другими прокариотами большие геномы - 3,1-4,5x10⁹ Да. однако геномы патогенных видов меньше, чем у других микобактерий (у М. tuberculosis - 2,5x10⁹ Да). У классического возбудителя туберкулёза человека, М. tuberculosis, больше генов, чем у М. africanum и М. bovis, которые утратили часть генетического материала в ходе эволюции.

В 1998 г. была опубликована нуклеотидная последовательность хромосомы штамма H37Rv М. tuberculosis. Её протяженность - 4 411529 пар оснований. Хромосома микобактерии туберкулёза представляет собой кольцевую структуру. В её составе определено около 4000 генов, кодирующих белки, а также 60. кодирующих функциональные компоненты РНК: уникальный рибосомальный РНК-оперон, 10Sa РНК. участвующий в деградации белков с нетипичной матричной РНК. 45 транспортных РНК (тРНК), более 90 липопротеинов.

Более 20% генома занимают гены метаболизма жирных кислот клеточной стенки, в том числе миколовых кислот, богатых глицином кислых полипептидов (семейства РЕ и РРЕ), кодируемых полиморфными участками генома PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) и MPTR (Major polymorphic tandem repeat), соответственно (пятое и четвёртое кольца геномной хромосомной карты). Вариабельность этих участков генома обеспечивает различия антигенов и способность ингибировать иммунный ответ. В геноме микобактерии туберкулёза широко представлены гены, контролирующие факторы вирулентности.

Микобактерии туберкулёза синтезируют все необходимые для обмена компоненты: незаменимые аминокислоты, витамины, ферменты и кофакторы. По сравнению с другими видами бактерий у М. tuberculosis повышена активность ферментов липогенеза. Два гена кодируют гемоглобинподобные белки, играющие роль антиокислительных протекторов или ловушек избытка клеточного кислорода. Эти особенности способствуют быстрой адаптации микобактерий туберкулёза к резким изменениям условий окружающей среды.

Особенность генома М.tuberculosis complex - большое число повторяющихся последовательностей ДНК. Так. в хромосоме М. tuberculosis H37Rv насчитывают до 56 копий IS-элементов (insertion sequences - встраивающихся последовательностей), которые обеспечивают ДНК-полиморфизм микобактерий туберкулёза. Большинство из них. за исключением элемента IS6110. неизменны. В составе хромосомы различных штаммов микобактерий туберкулёза, как правило, присутствует от 5 до 20 копий IS6110, однако встречаются штаммы, не имеющие данного элемента. Наряду с IS-элементами геном содержит несколько типов коротких повторов нуклеотидов (PGRS и MPTR), а также прямые повторы DR (Direct Repeat), находящиеся в DR-области и разделённые вариабельными последовательностями - спейсерами (шестое кольцо на карте хромосомы). Различия в количестве копий и локализации на хромосоме этих генетических элементов используют для дифференциации штаммов микобактерий туберкулёза в молекулярной эпидемиологии. Наиболее совершенные схемы генотипирования микобактерий основаны на выявлении геномного полиморфизма, обусловленного элементом IS6110, а также DR и их спейсерами. Характерно, что дивергенция вида М. tuberculosis происходит, как правило, за счёт рекомбинаций между копиями элемента IS6110. которые фланкируют различные гены.

В геноме H37Rv найдены два профага - phiRv1 и phiRv2. Как и полиморфный сайт Dral они. вероятно, ассоциированы с факторами патогенности, поскольку именно эти участки генома отличаются от аналогичных участков авирулентных штаммов М. tuberculosis H37Ra и М. bom BCG, Определены участки генома (mutT, ogt-genes), отвечающие за увеличение частоты мутаций и адаптацию микобактерий туберкулёза в прессовых условиях. Обнаружение триггерных генов дормантности микобактерий туберкулёза изменило представление о латентной туберкулёзной инфекции.

Изучение полиморфизма генов, кодирующих каталазу, пероксидазу и А-субъединицу ДНК-гиразы. у М. tuberculosis complex были выделены три генотипические группы. Наиболее древняя (с точки зрения эволюции) I группа: М. аfricanum, М. bovis. М. tuberculosis и М. microti. II и III группы включают различные штаммы М. tuberculosis, получившие распространение в некоторых географических регионах. Клональное поведение характерно для I и II групп, а штаммы III группы крайне редко вызывают массовые заболевания. В различных регионах мира распространены генетические семейства М. tuberculosis, получившие наименования Haarlem. Africa, Filipino.

Особое место занимает семейство Beijing, впервые выявленного в гистологических препаратах лёгочной ткани 1956-1990 гг. от больных предместья Пекина. На сегодняшний лень штаммы этого семейства обнаружены в государствах Азии. Южной Африки, странах Карибского бассейна, США. Распространение данного генотипа на различных территориях определяется этническими характеристиками коренного населения и мигрантов. Недавно получены данные о распространении штаммов генотипа SI/Beijing на северо-западе европейской части России (Санкт-Петербург) и в регионах Сибири.

Устойчивость микобактерий

В ходе эволюции микобактерии туберкулёза выработали различные механизмы преодоления или инактивации неблагоприятных факторов внешней среды. Во-первых. это мощная клеточная стенка. Во-вторых, это обширные метаболические возможности. Они способны инактивировать многие клеточные токсины и вещества (различные перекиси, альдегиды и другие), разрушающие клеточную оболочку. В-третьих, это морфологическая пластичность, заключающаяся в трансформации микобактерий (образование L-форм. дормантным клеток). По своей устойчивости, после спорообразующих бактерий, они занимают лидирующее место в царстве прокариот.

Возбудитель сохраняет свою жизнеспособность в сухом состоянии до 3 лет. При нагревании микобактерии туберкулёза могут выдерживать температуру существенно выше 80С. На сегодняшний день считают, что микобактерии туберкулёза, находящиеся в мокроте, остаются жизнеспособными при открытом кипячении последней в пределах 5 мин.

Микобактерии туберкулёза устойчивы к органическим и неорганическим кислотам, щелочам, многим окислителям, а также к ряду антисептических и дегидратирующих веществ, оказывающих губительное действие на другие патогенные микроорганизмы. Микобактерии проявляют устойчивость к воздействию спиртов и ацетона.

Отмечено, что средства на основе четвертичного аммония не проявляют противотуберкулезной активности В определенных условиях концентрации радикалов хлора и кислорода до 0,5% также не оказывают губительного действия на микобактерии туберкулёза. Это подразумевает невозможность использования подобных средств для стерилизации мокроты и других инфицированных биологических материалов.

Микобактерии туберкулёза нечувствительны к рассеянному солнечному свету и могут более года существовать во внешней среде без потери жизнеспособности. Коротковолновое ультрафиолетовое изучение оказывает универсальное бактерицидное действие на все микроорганизмы. Однако в реальных условиях, когда микобактерии туберкулёза находятся во взвешенном состоянии в виде клеточных агломератов с пылевыми частицами, их устойчивость к ультрафиолетовому излучению возрастает.

Высокая выживаемость микобактерий туберкулёза способствует чрезвычайно широкому распространению этой инфекции среди населения независимо от климатических условий. Однако не только это способствует глобализации проблемы - микобактерии туберкулёза могут длительно персистировать в организме человека и реактивироваться через неограниченные промежутки времени.

Локализация микобактерии туберкулёза внутри макрофагов обеспечивает, достаточную субстратную стабильность, учитывая «долгожительство» мононуклеарных фагоцитов и длительность репликации микобактерий, а также изоляцию от эффекторов гуморального иммунитета. В то же время возбудитель выбирает биотоп, который из-за потенциальной опасности неприемлем для большинства микроорганизмов. Этот симбиоз обеспечивается целым рядом приспособительных механизмов микобактерий.

Процесс поражения макрофага и паразитирования в нем выглядит следующим образом: проникновение микобактерий в макрофаг без его активации; подавление образования фаголизосом или трансформация их в зону, комфортную для бактерий; прорыв из фагосом в цитоплазму с инактивацией антимикробных факторов; вмешательство в жизнедеятельность клетки; ослабление чувствительности макрофагов к активирующим сигналам Т-лимфоцитов; снижение антигенпредставляющей функции макрофагов и сопряжённое с этим ослабление реакций цитотоксических Т-лимфоцитов, настроенных на уничтожение заражённых клеток.

Безусловно, в обеспечении этого важную роль играют особенности клеточной стенки. а также метаболические и функциональные возможности. При первом контакте с микобактериями иммунные системы макроорганизма не способны подключить гуморальный иммунитет, быстро обезвредить и элиминировать клетку из организма, так как подвижные алифатические цепи микобактериальной стенки не дают возможности провести оценку поверхностных структур возбудителя и передать соответствующую информацию для синтеза необходимого набора антител.

Высокая гидрофобность микобактерий обеспечивает неспецифические, т.е. независимые от рецепторов, контакты с макрофагами. Образуя вокруг клетки микобактерии фагосому, макрофаг помещает её внутри себя. Поверхностные микозидные и липоарабиноманнановые комплексы могут распознаваться рецепторами, однако запускаемые через них сигналы не активируют или слабо активируют макрофаги. Вследствие этого фагоцитоз не сопровождается выделением свободнорадикальных форм кислорода и азота. Считают, что в большей степени это характерно для вирулентных штаммов М. tuberculosis, которые благодаря структурным особенностям липоарабиноманнана, инициируют «неагрессивный» фагоцитоз. В распознавании М. tuberculosis принимают участие и другие рецепторы макрофагов, в частности CD 14 и рецепторы СЗ-компонента комплемента (CR1-CR3).

Проникнув внутрь макрофага, микобактерия включает ряд механизмов, препятствующих образованию фаголизосомы: продуцирование аммония, который защелачивает среду внутри фагосомы, синтез сульфолипидов, ведущий к формированию отрицательного заряда на поверхности фагосомы. что препятствует слиянию фагосомы и лизосомы.

Если всё же фаголизосома образовалась, микобактерия благодаря мощной восковой оболочке способна погасить свободнорадикальные реакции, вызываемые бактерицидными веществами фагоцитов. Аммоний защелачивает среду, блокируя активность лизосомальных ферментов, а сульфолипиды нейтрализуют мембранотропные катионные белки. Кроме того, микобактерии туберкулёза продуцируют высокоактивные ферменты с каталазной и пероксидазной активностью, которые конкурируют с пероксидазными системами макрофагов, и одновременно инактивируют гидропероксиды лизосом Всё это повышает устойчивость микобактерий к оксидантному стрессу.

Дальнейшая адаптация микобактерий состоит в использовании железосодержащих соединении макрофагов для своих ферментных систем и блокирования иммуноспецифических функций макрофагов. Макрофаги являются одним из главных резервуаров железа, избыток которого накапливается в виде ферритина. Содержание железа в альвеолярных макрофагах в 100 раз выше, чем в моноцитах крови, что, безусловно, содействует их колонизации микобактериями туберкулёза.

Токсическое действие на макрофаги микобактерии осуществляют посредством эндотоксинов и неспецифических факторов. И те, и другие поражают в первую очередь дыхательную систему макрофагов - митохондрии. К эндотоксинам относят миколовые арабинолипиды, которые угнетают дыхание митохондрий. К неспецифическим токсинам относят продукты синтеза липидной части клетки микобактерии - фтиеновые и фтионовые кислоты, которые вызывают разобщение окислительного фосфорилирования. Усиление метаболических процессов в этих условиях не сопровождается должным синтезом АТФ. Клетки хозяина начинают испытывать энергетический голод, что приводит к угнетению их жизнедеятельности, а в дальнейшем к цитолизу и апоптозу.

Не исключено, что некоторые факторы патогенности образуются только внутри заражённых клеток, как это происходит у других бактерий, предпочитающих внутриклеточный образ жизни. Например, сальмонеллы, паразитируя внутри макрофагов, дополнительно экспрессируют более 30 генов. Несмотря на полное описание генома микобактерии туберкулёза. 30% кодонов имеют отношение к белкам с неизвестными свойствами.

Лекарственная устойчивость микобактерий

С клинической точки зрения лекарственная чувствительность микроорганизма определяет возможность применения стандартной химиотерапии показанным препаратом для лечения заболевания, вызванного выделенным штаммом. Устойчивость «предсказывает неудачу лечения тестируемым химиопрепаратом». Иными словами, использование стандартной химиотерапии, приводящей к достижению системной концентрации препарата, обычно эффективной в нормальных условиях, не подавляет размножения «устойчивых микроорганизмов».

В микробиологии в основе определения лекарственной чувствительности или лекарственной устойчивости лежит популяционный подход, подразумевающий разную степень устойчивости пула (разнородной совокупности) микробных клеток. Лекарственную устойчивость оценивают в количественных характеристиках, таких, как «минимальная ингибирующая концентрация» (МИК). Например, при МИК-90 гибнет 90% микроорганизмов (бактериостатическая концентрация). Таким образом, под резистентностью следует понимать её степень у части микробной популяции, которая предопределяет неудачу лечения в большинстве случаев. Общепринято, что 10% устойчивых штаммов среди всей микробной популяции больного способно оказать патогенное действие. Во фтизиобактериологии для противотуберкулёзных препаратов первого ряда она составляет 1%. или 20 колониеобразующих единиц - КОЕ). Такая часть микробной популяции через месяц способна вытеснить исходную и сформировать очаг поражения. Для противотуберкулёзных препаратов второго ряда критерием устойчивости служит 10% рост микробной популяции.

Развитие лекарственной устойчивости микроорганизмов связано с селекцией (отбором) в присутствии антибиотика и с преимущественным выживанием части микробной популяции, имеющей механизмы защиты против антибактериального агента. В каждой популяции находится незначительное количество мутантных клеток (как правило, 10⁶-10⁹), резистентных к тому или иному препарату. При проведении химиотерапии погибают чувствительные микробные клетки, а резистентные размножаются. В результате происходит замещение чувствительных клеток устойчивыми.

Микобактерии исходно обладают высокой природной устойчивостью ко многим антибактериальным препаратам широкого спектра действия, однако у разных видов - различные спектр и степень этой чувствительности.

Под истинной природной устойчивостью понимают постоянный видовой признак микроорганизмов, связанный с отсутствием мишени действия антибиотика или недоступностью мишени вследствие первично низкой проницаемости клеточной стенки, ферментативной инактивации вещества или других механизмов.

Приобретённая устойчивость - свойство отдельных штаммов сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Приобретение резистентности во всех случаях обусловлено генетически: появлением новой генетической информации или изменением уровня экспрессии собственных генов.

В настоящее время обнаружены различные молекулярные механизмы устойчивости микобактерий туберкулёза:

• инактивация антибиотика (ферментная инактивация), например, β-лактамазами;
• модификация мишени действия (изменение пространственной конфигурации белка вследствие мутации соответствующего участка генома):
• гиперпродукция мишени, приводящая к изменению соотношения агент-мишень и высвобождению части белков жизнеобеспечения бактерии;
• активное выведение препарата из микробной клетки (эффлюкс) вследствие включения стрессорных механизмов защиты:
• изменение параметров проницаемости внешних структур микробной клетки, блокирующих способность антибиотика проникать внутрь клетки;
• включение «метаболического шунта» (обходного пути обмена).

Помимо прямого воздействия на метаболизм микробных клеток, многие антибактериальные препараты (бензилпенициллин. стрептомицин, рифампицин) и другие неблагоприятные факторы (биоциды иммунной системы) приводят к появлению изменённых форм микобактерий (протопласты, L-формы). а также переводят клетки в дормантное состояние: интенсивность обмена клетки снижается и бактерия становится невосприимчивой к действию антибиотика.

Все механизмы формируют разную степень устойчивости, обеспечивая резистентность к разным концентрациям химиопрепаратов, поэтому появление у бактерий устойчивости не всегда сопровождается снижением клинической эффективности антибиотика. Для оценки эффективности и прогноза лечения важно знать степень резистентности.

В настоящее время для каждого противотуберкулёзного препарата первого ряда и для большинства резервных препаратов определён хотя бы один ген. специфические мутации в котором приводят к развитию устойчивых вариантов микобактерий. В широком распространении лекарственной устойчивости у микобактерий имеет значение высокая частота мутаций in vivo, большая, чем in vitro.

[29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Виды лекарственной устойчивости микобактерий

Различают первичную и приобретённую лекарственную устойчивость. К микроорганизмам с первичной устойчивостью относят штаммы, выделенные от пациентов, не получавших специфическую терапию или получавших препараты в течение месяца или менее. При невозможности уточнения факта применения противотуберкулёзных препаратов используют термин «начальная устойчивость».

Первичная лекарственная устойчивость имеет большое клиническое и эпидемиологическое значение, поэтому для правильной её оценки необходимо не проводить впервые выявленному больному туберкулёзом химиотерапию до микробиологического исследования диагностического материала. Частоту первичной лекарственной устойчивости рассчитывают как отношение количества впервые выявленных больных туберкулёзом с первичной резистентностью к числу всех впервые выявленных больных, которым проводили исследование на лекарственную чувствительность в течение гола Если устойчивый штамм выделен у пациента на фоне противотуберкулёзной терапии, проводимой в течение месяца и более, устойчивость расценивают как приобретённую. Частота первичной лекарственной устойчивости характеризует эпидемиологическое состояние популяции возбудителя туберкулёза.

Приобретённая лекарственная устойчивость среди впервые выявленных больных - результат неудачного лечения (неверный подбор препаратов, несоблюдение режима приёма, снижение дозировок препаратов, непостоянное снабжение и плохое качество препаратов). Эти факторы приводят к снижению системной концентрации препаратов в крови и их эффективности, одновременно «запуская» в клетках микобактерий защитные механизмы.

Для эпидемиологических целей рассчитывают частоту ранее леченых случаев. Для этого в расчёт берут больных, зарегистрированных на повторное лечение после неудачного курса химиотерапии или рецидивов. Рассчитывают отношение количества резистентных культур микобактерий туберкулёза к числу всех штаммов, исследованных на наличие лекарственной устойчивости в течение года среди больных данной группы на момент их регистрации.

В структуре лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёза различают:

Монорезистентность - устойчивость к одному из противотуберкулёзных препаратов, чувствительность к другим препаратам сохранена. При применении комплексной терапии монорезистентность выявляют довольно редко и. как правило, к стрептомицину (в 10-15% случаев среди впервые выявленных больных).

Полирезистентность - устойчивость к двум и более препаратам.

Множественная лекарственная устойчивость - устойчивость к изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия устойчивости к другим препаратам). Она сопровождается, как правило, устойчивостью к стрептомицину и др. В настоящее время МЛУ возбудителей туберкулёза стала эпидемиологически опасным явлением. Расчёты показывают, что выявление возбудителей с МЛУ более чем в 6,6% случаев (среди впервые выявленных больных) требует изменения стратегии Национальной противотуберкулёзной программы. По данным мониторинга лекарственной устойчивости, частота МЛУ среди впервые выявленных больных составляет от 4 до 15%, среди рецидивов - 45-55%, а среди случаев неудачного лечения - до 80%.

Суперустойчивость - множественная лекарственная устойчивость в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и одному из инъекционных препаратов (канамицин, амикацин, капреомицин). Туберкулёз, вызванный штаммами с суперустойчивостью, представляет прямую угрозу для жизни пациентов, так как остальные противотуберкулёзные препараты второго ряда не имеют выраженного антибактериального действия. С 2006 г. в некоторых странах организовано наблюдение за распространением штаммов микобактерий с суперустойчивостью. За рубежом принято обозначать этот вариант МЛУ как XDR.

Перекрёстная устойчивость - когда возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим препаратам. У М. tuberculosis, как правило, ассоциированные с устойчивостью мутации не взаимосвязаны. Развитие перекрёстной устойчивости обусловлено сходством химической структуры некоторых противотуберкулёзных препаратов. Особенно часто перекрёстную устойчивость выявляют внутри одной группы препаратов, например аминогликозидов. Для прогнозирования перекрёстной резистентности необходимы исследования культуры микобактерий на генетическом уровне в сочетании с микробиологическим изучением устойчивости.

Нетуберкулезные микобактерии

Нетуберкулёзные микобактерии передаются от человека к человеку крайне редко. Частота выделения некоторых их видов из материала от больных сопоставима с частотой выделения этих видов из объектов внешней среды. Источниками заражения могут быть сельскохозяйственные животные и птицы, необработанные продукты. Микобактерии обнаруживают в послеубойном материале и молоке крупного рогатого скота.

По данным бактериологических лабораторий, распространённость нетуберкулёзных микобактерий в 2004-2005 гг. составила 0.5-6.2% среди всех микобактерий у впервые выявленных больных. Вероятно, частота может быть несколько выше, так как используемый способ обработки диагностического материала не является оптимальным для нетуберкулёзных микобактерий. Сапрофитные микобактерии могут присутствовать в диагностическом материале при несоблюдении правил сбора, или в силу особенностей материала (например. М. smegmatis может выделяться из мочи пациентов мужского пола).

В связи с этим важно многократно подтвердить обнаруженный вида микобактерий из материала от больного.

Микобактерии поражают кожные покровы, мягкие ткани, а также могут вызывать микобактериоз лёгких, что особенно часто при иммунодефицитных состояниях. При лёгочной локализации чаще выявляется у мужчин пожилого возраста, в анамнезе которых есть хронические лёгочные заболевания, в том числе с грибковыми поражениями.

Из всех микобактерий комплекс М. avium-intracellularae является наиболее распространённым возбудителем микобактериозов лёгких у человека. Он вызывает заболевания лёгких, периферических лимфатических узлов и диссеминированные процессы. На севере европейского региона около 60% микобактериозов лёгких. Преобладают фиброзно-кавернозные и инфильтративные процессы, принимающие хроническое течение из-за высокой резистентности к противотуберкулёзным препаратам.

М. kansasii являются возбудителями хронического заболевания лёгких, напоминающее туберкулёз. Химиотерапия более эффективна, вследствие более высокой чувствительности М. kansasii к антибактериальным препаратам. М. xenopi и М. malmoense вызывают, главным образом, хронические заболевания лёгких. Они могут загрязнять водопроводную систему горячей и холодной воды. Ареал обитания М. malmoens не вполне установлен. М. xenopi проявляют достаточно хорошую чувствительность к противотуберкулёзной терапии. М. malmoense проявляют достаточно высокую чувствительность к антибиотикам in vitro, но консервативное лечение часто неэффективно вплоть до летального исхода. М. fortuitum и М. chelonae признаны возбудителями заболеваний костей и мягких тканей вследствие прямого заражения раны при травме, хирургическом вмешательстве и проникающем ранении. Они вызывают до 10% микобактериозов лёгких. Протекает как хроническое деструктивное двустороннее поражение, часто летально. Противотуберкулёзные препараты и антибиотики широкого спектра действия не активны или мало активны против этих видов микобактерий.

В южных регионах распространение имеют микобактериозы кожных покровов и мягких тканей, вызываемые М. leprae, М. ulceranse. Выявление нетуберкулёзных микобактерий проводят в лабораториях ведущих противотуберкулёзных учреждений страны. Это требует высокой квалификации и хорошего оснащения лабораторий.