Иммунофенотипирование гемобластозов

Значительный прогресс в гематологических исследованиях связан в последние годы с использованием современных иммунологических методов и автоматизированных средств анализа и сортировки клеток периферической крови и костного мозга - проточных цитометров. Традиционные морфологические и цитохимические исследования клеток субстрата болезни (кровь, красный костный мозг, лимфатические узлы, селезёнка и т.д.) во многих случаях, особенно при лимфопролиферативных заболеваниях, не позволяют выявить всё многообразие вариантов среди морфологически сходных форм и установить источник происхождения патологического клона. Эти задачи могут быть решены только путём изучения иммунологической характеристики клеток. Каждой стадии дифференцировки гемопоэтических клеток соответствует свой набор антигенов, которые по международной классификации называются дифференцировочными и разделяются на кластеры дифференцировки, обозначаемые CD.

При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику. Проведя исследования этих маркёров на клетках, можно определить, какой форме и варианту заболевания они соответствуют, то есть на основе иммунологического фенотипа клеток проводить дифференциальную диагностику, которая наиболее трудна при лимфопролиферативных заболеваниях, потому что основной клеткой патологического субстрата болезни являются морфологически почти однотипные клетки.

Фенотипирование позволяет с помощью моноклональных антител типировать бластные и зрелые клетки крови миело-, моно-, лимфоцитарного ряда по наличию дифференцировочных антигенов (рецепторов) в клеточной стенке. В разделе «Оценка иммунного статуса организма» частично изложена характеристика и диагностическое значение исследования клеточных маркёров; ниже приведена краткая характеристика антигенных маркёров клеток применительно к диагностике гемобластозов. На мембранах клеток крови и красного костного мозга можно выявить следующие антигены (маркёры).

• CD2 - мономерный трансмембранный гликопротеид. Он присутствует на поверхности всех циркулирующих в крови Т-лимфоцитов и на некоторых NK-лимфоцитах. CD2 принимает участие в процессе альтернативной активации Т-лимфоцитов. Выявление CD2 с помощью моноклональных антител в клинической практике используют для фенотипирования острых Т-клеточных лейкозов, лимфом, хронических воспалительных и иммунодефицитных состояний.
• CD3 - белковый комплекс, ассоциированный с антиген-специфическим Т-клеточным рецептором, это основной функциональный маркёр Т-лимфоцитов. Он способствует передаче сигнала активации с мембраны в цитоплазму клетки. Определение CD3 показано для диагностики острых Т-клеточных лейкозов, лимфом (CD3 не экспрессируется при не-Т-клеточных лимфоидных новообразованиях) и иммунодефицитных заболеваний.
• CD4 - трансмембранный гликопротеид, экспрессируемый субпопуляцией Т-хелперов (индукторов), составляющих 45% лимфоцитов периферической крови. На ранних стадиях развития лимфоцитов в тимусе, антигены CD4, так же как CD8, экспрессируется всеми кортикальными лимфоцитами. Медуллярные тимоциты, фенотип которых схож со зрелыми CD4+Т-клетками периферической крови (Т-хелперы), экспрессируют уже либо CD4, либо CD8 рецепторы. В периферической крови до 5% клеток несут одновременно маркёры CD4 и CD8. Незначительная экспрессия CD4 возможна на некоторых клетках моноцитарного ряда. CD4 экспрессируется в большинстве случаев Т-клеточных лимфом, включая грибовидный микоз, а также при HTLV-ассоциированном Т-клеточном лейкозе (HTLV - human T-lymphotropic virus - Т-лимфотропный вирус человека).
• CD5 - одноцепочечный гликопротеид, присутствующий на всех зрелых Т-лимфоцитах и большинстве тимоцитов, слабо экспрессируется В-лимфоцитами. CD5 выявляют на неопластических клетках В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза и центроцитарной лимфомы. При других типах злокачественных лимфоидных заболеваний - фолликулярной лимфоме, волосатоклеточном лейкозе, крупноклеточной лимфоме - CD5 не экспрессируется.
• CD7 - одноцепочечный белок, самый ранний маркёр Т-клеточной дифференцировки. Он экспрессируется про-Т-лимфоцитами ещё до миграции их в тимус. CD7 выявляют на большинстве NK-клеток, слабая экспрессия отмечена на моноцитах. В-лимфоциты и гранулоциты не содержат этого антигена. Определение CD7 применяют в целях диагностики лимфом, детских Т-клеточных лимфобластных лейкозов.
• CD8 - белок, состоящий из двух полипептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками. Он экспрессируется субпопуляцией цитотоксических и супрессорных Т-лимфоцитов, которые составляют 20-35% лимфоцитов периферической крови. Этот антиген имеют также NK-лимфоциты, кортикальные тимоциты, 30% медуллярных тимоцитов и субпопуляции клеток красного костного мозга. CD8 исследуют для количественной оценки содержания Т-супрессоров (см. выше раздел «Т-лимфоциты-супрессоры в крови»).

• CD10 - ассоциированная с клеточной мембраной эндопептидаза. CD10 экспрессируют молодые формы В-лимфоцитов и субпопуляция кортикальных лимфоцитов. CD10 экспрессируют все клетки ОЛЛ.
• CD11с экспрессируют на клеточной мембране макрофаги, моноциты, гранулоциты, NK-клетки и клетки волосатоклеточного лейкоза.
• CD13 - гликопротеид, экспрессируемый клетками миеломоноцитарного ряда (клетки-предшественники, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты и клетки миелоидных лейкозов). Он отсутствует на Т и В-лимфоцитах, эритроцитах и тромбоцитах.
• CD14 - поверхностный мембранный гликопротеид. Его экспрессируют в основном моноциты и макрофаги. CD14 определяют более чем на 95% моноцитах периферической крови и костного мозга. Сильную экспрессию CD14 наблюдают при острых миелобластных лейкозах. При острых и хронических лимфобластных лейкозах этот антиген не экспрессируется.
• CD15 представляет собой олигосахарид. Он принимает участие в процессах фагоцитоза и хемотаксиса. Этот антиген присутствует на поверхности зрелых гранулоцитов и клетках Березовского-Штернберга. Экспрессию антигена CD15 выявляют при болезни Ходжкина. При неходжкинских лимфомах CD15 в большинстве случаев не обнаруживают.
• CD16 экспрессируется на поверхности гранулоцитов, моноцитов, макрофагов и NK-клеток. Все лимфоциты, экспрессирующие этот антиген, обладают способностью к антителозависимой клеточной цитотоксичности. CD16 определяют при типировании хронических миелоцитарных лейкозов, для характеристики NK-клеток.
• CD19 - гликопротеин, присутствующий на всех периферических В-лимфоцитах, а также на всех предшественниках В-клеток. Он отсутствует на плазматических клетках. Это самый ранний маркёр В-клеток, играет важную роль в регуляции активации и пролиферации В-лимфоцитов. CD19 экспрессируется на всех неопластических клетках острых лейкозов В-клеточного происхождения, а также присутствует при некоторых формах острых монобластных лейкозов.
• CD20 - негликозилированный белок. В онтогенезе В-лимфоцитов антиген CD20 появляется после CD19 на стадии пре-В-клеточной дифференцировки лимфоцитов. На плазматической мембране плазматических клеток он отсутствует. Экспрессируется при ОЛЛ, В-клеточных хронических лимфоцитарных лейкозах, волосатоклеточных лейкозах, лимфомах Беркитта и очень редко - при острых монобластных лейкозах.
• CD21 - гликопротеид, в значительном количестве присутствует на В-лимфоцитах в лимфоидных органах и в небольшом количестве - на В-клетках периферической крови. CD21 - рецептор для вируса Эпстайна-Барр.
• CD22 - белок, состоящий из двух полипептидных цепей. Экспрессируется на мембране большинства В-лимфоцитов, включая клетки-предшественники (пролимфоциты). Антиген не экспрессируется на В-лимфоцитах (плазматические клетки) после их активации. Наиболее выраженную экспрессию CD22 выявляют на клетках при волосатоклеточном лейкозе, слабую - при миелоидных лейкозах и не-Т-клеточных ОЛЛ.
• CD23 - гликопротеид, экспрессируемый активированными В-лимфоцитами периферической крови в гораздо большей степени. CD23 опосредует IgE-зависимую цитотоксичность и фагоцитоз макрофагами и эозинофилами.
• CD25 - одноцепочечный гликопротеид, идентифицированный как низкоаффинный рецептор к ИЛ-2. Этот рецептор экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и, с меньшей плотностью, на активированных В-клетках. В периферической крови здоровых людей антиген присутствует более чем на 5% лимфоидных клеток.
• CD29 - рецептор фибронектина. Широко распространён в тканях, экспрессируется лейкоцитами. Определение CD29 на клетках периферической крови используют для типирования субпопуляции Т-клеток, имеющих фенотип CD4+CD29+, которые называют хелперами 2 типа (Th2). Эти клетки посредством продукции лимфокинов участвуют в реализации гуморального иммунного ответа.
• CD33 - трансмембранный гликопротеид. Присутствует на поверхности клеток миелоидного и моноцитарного рядов. Его обнаруживают на поверхности моноцитов и, в меньшей степени, гранулоцитов периферической крови. Приблизительно 30% клеток красного костного мозга экспрессируют CD33, включая миелобласты, промиелоциты и миелоциты. Антиген отсутствует на мембранах полипотентных стволовых клеток. Определение CD33 используют для характеристики клеток при лейкозах миелоидного происхождения. Клетки лейкозов лимфоидного и эритроидного происхождения не экспрессируют CD33.
• CD34 - фосфогликопротеин, экспрессируется гемопоэтическими клетками-предшественниками, включая монопотентные стволовые клетки. Наиболее выраженную экспрессию Аг наблюдают у ранних предшественников; при созревании клеток экспрессия маркёра падает. CD34 обнаружен также на эндотелиальных клетках. Определение CD34 используют для характеристики клеток при острых миело- и лимфобластных лейкозах. При хронических лимфоцитарных лейкозах и лимфомах экспрессии антигена CD34 не выявляют.

• CD41а экспрессируется тромбоцитами и мегакариоцитами. Моноклональные антитела для выявления CD41а используют для диагностики мегакариобластного лейкоза. При тромбастении Глянцманна экспрессия этого антигена отсутствует или значительно подавлена.
• CD42b - мембранный гликопротеид, состоящий из двух полипептидных цепей. Маркёр выявляют на поверхности тромбоцитов и мегакариоцитов. В клинической практике обнаружение CD42b используют для диагностики тромбоцитопатии - синдрома Бернара-Сулье.
• CD45RA принадлежит к классу трансмембранных гликопротеинов. Это общий лейкоцитарный антиген. Экспрессируется на клеточной мембране В-лимфоцитов, в меньшей степени Т-лимфоцитов и на зрелых медуллярных тимоцитах. Маркёр не экспрессируется гранулоцитами.
• CD45RО - низкомолекулярная изоформа CD45RA - общего лейкоцитарного Аг. Выявляют на Т-клетках (Т-лимфоциты памяти), субпопуляции В-лимфоцитов, моноцитах и макрофагах. Моноклональные АТ к CD45RО взаимодействуют с большинством тимоцитов, субпопуляцией покоящихся CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и зрелыми активированными Т-клетками. Клетки миеломоноцитарного происхождения, гранулоциты и моноциты также несут этот антиген. Его выявляют при центробластных и иммунобластных лимфомах.
• CD46 - О-гликозилированный димер. Он широко распространён в тканях и экспрессируется Т- и В-лимфоцитами, моноцитами, гранулоцитами NK-клетками, тромбоцитами, эндотелиальными клетками, фибробластами, но отсутствует на поверхности эритроцитов. CD46 обеспечивает защиту тканей от действия комплемента.
• CD61 - тромбоцитарный антиген. Экспрессируется на тромбоцитах периферической крови и красного костного мозга, а также на мегакариоцитах и мегакариобластах. Его определение используют в качестве маркёра при острых мегакариобластных лейкозах. Экспрессия антигена отсутствует или подавлена у больных с тромбастенией Глянцманна.
• CD95, называемый также Fas или APO-1, - трансмембранный гликопротеин, член семейства рецепторов фактора некроза опухолей. Он экспрессируется в значительных количествах на Т-лимфоцитах (CD4+ и CD8+) периферической крови и, в меньшей степени, на В-лимфоцитах и NК-клетках. Этот антиген экспрессируется также на гранулоцитах, моноцитах, клетках тканей и неопластических клетках. Связывание CD95 с Fas-лигандом (CD95L), индуцирует в клетках апоптоз.
• CD95L, или Fas-лиганд, мембранный белок, относящийся к семейству рецепторов фактора некроза опухолей. Этот антиген экспрессируется цитотоксическими Т-лимфоцитами, NК-клетками и очень часто опухолевыми клетками; основной индуктор апоптоза в клетках.
• HLA-DR - мономорфная детерминанта молекул II класса главного комплекса гистосовместимости человека (HLA). Маркёр экспрессируется на клетках Лангерганса, дендритных клетках лимфоидных органов, определённых типах макрофагов, В-лимфоцитах, активированных Т-клетках и эпителиальных клетках тимуса. Исследование на данный маркёр используют для количественного определения активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+ HLA-DR+.

Используя различный подбор моноклональных антител к маркёрам, можно составить фенотипический портрет клеток, характерных для данной формы лейкоза.

Помимо использования методов иммунофенотипирования для диагностики и дифференциальной диагностики гемобластозов, особенно важным оказалось их применение в процессе лечения для оценки состояния ремиссии и остаточной популяции лейкозных клеток. Зная фенотипический «портрет» бластных клеток в период установления диагноза, по этим маркёрам удаётся обнаружить клетки лейкозного клона в период ремиссии, а по нарастанию их количества - предсказать развитие рецидива задолго (за 1-4 мес) до появления его клинико-морфологических признаков.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]