^

Здоровье

Эмбриональные стволовые клетки

Открытие эмбриональных стволовых клеток - возникло не случайно, а появилось на подготовленной почве научных исследований в области биологии развития. Термин “стволовая клетка” был введен в медицину еще в 1908 году на съезде гематологического общества в Берлине Александром Максимовым применительно к гемопоэтическим клеткам. Задолго до выделения и получения стабильных линий плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток в исследованиях процессов раннего развития применялись стволовые терато-(эмбрио-карциномные клетки, с помощью которых изучались неизвестные механизмы эмбриогенеза, в том числе последовательность экспрессии ранних генов и белковых продуктов их деятельности.

Но безвозвратно ли потеряна в процессе эволюции тотипотентность генома человека? Нет, и эмбриогенез тому доказательство. Раз это так, то когда сможет, в принципе, реализоваться второй путь эволюционного развития? Вероятно, при выходе человека в Космос, где условия окружающей среды будут относительно постоянны достаточно длительное время. Потерю костной ткани (деминерализация костей в состоянии невесомости), очень медленно поддающейся ремоделированию и регенерации, можно рассматривать как первый шаг к процессу адаптации человека, как вида, к существованию в условиях Космоса. Однако плата за второй путь эволюционного развития будет иной - платой за возврат всем клеткам тотипотентности и абсолютной пластичности будет стерильность. Так что размножаться в этом мире “эволюционных хамелеонов” придется без мейоза, отпочкованием. Зато жить будем долго. Теломеразное бессмертие - это бессмертие амебы. В многоклеточном организме субстратом количественного и качественного долголетия являются стволовые клетки.

Источники эмбриональных стволовых клеток

Сегодня источниками эмбриональных стволовых клеток для лабораторных исследований являются линии мышиной тератокарциномы (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) и тератокарциномы человека (NTERA-2, TERA-2, H-9 clone), а также линии ЭСК Траунеона. Однако наличие подробного клеточного паспорта с указанием иммунного фенотипа, результатов хромосомного анализа, профилей экспрессии мРНК, экспонированных рецепторов и белков внутриклеточной сигнализации не восполняют существенных недостатков тератокарциномных линий ЭСК - быстрой утраты тотипотентности и невозможности применения в клинических испытаниях, а смешанная дифференцировка в культуре весьма затрудняет выделение чистой специализированной линии из гетерогенной популяции клеток. Поэтому обычно источником линий ЭСК, создаваемых для клинических нужд, служит внутренняя клеточная масса бластоцисты, отдельные бластомеры зародышей 8-клеточной стадии развития, клетки морулы более поздних стадий, а также первичные половые клетки.

Следует заметить, что клетки тератокарциномы, хотя и имеют свойство плюрипотентности, по сравнению с ЭСК характеризуются значительно более низким плюрипотентным потенциалом. Их интеграция с клетками эмбрионов редко приводит к формированию химер, у которых, к тому же, никогда не образуются гаметы с генотипом тератокарциномных клеток. Считается, что это обусловлено частым появлением при культивировании клеток тератокарцином хромосомных аномалий: потеря У-хромосомы, разнообразные трисомии, делеции или транслокации.

Попытки выделить линию ЭСК человека предпринимались неоднократно, однако эту задачу не удавалось решить, поскольку нормальные бластоцисты человека являются труднодоступными объектами. Кроме того, у человека частота хромосомных аномалий выше, чем в эмбриогенезе животных. У преобладающего большинства ранних зародышей человека, полученных после оплодотворения in vitro, обнаруживается хаотический хромосомный мозаицизм и часто встречаются числовые и структурные аберрации. Даже позже, на стадии бластоцисты, лишь 20-25% зародышей человека состоят из клеток с нормальным кариотипом. Использовать таких зародышей для создания ЭСК было практически невозможно, поскольку зиготы, как правило, культивировались до стадий двух или четырех бластомеров и затем трансплантировались в матку. Лишь относительно недавно была разработана надежная техника культивирования оплодотворенных яйцеклеток человека до стадии бластоцисты. Внедрение этой техники в практику экстракорпорального оплодотворения не только повысило частоту успешного исхода имплантации, но и сделало нормальные бластоцисты более доступным объектом.

Еще одним плюрипотентным стволовым клеточным источником являются первичные половые клетки, которые, в отличие от более продвинутых прогениторных популяций герменативного эпителия, не имеют на своей поверхности бета-интегрина, но экспрессируют высокую активность шелочной фосфатазы. Надо заметить, что в эксперименте популяции стволовых клеток, которые образовались из первичных половых клеток, исследуются с 80-х годов прошлого столетия. Тогда же была разработана и техника выделения первичных половых клеток из зачатка гонады мышиного зародыша. Первые неудачные результаты культивирования первичных половых клеток in vitro наводили на мысль о бесперспективности этих попыток, поскольку клетки, хотя и выживали, но не пролиферировали и погибали в течение первых суток. В дальнейшем было установлено, что мышиные первичные половые клетки размножаются in vitro только при наличии в культуральной среде растворимых и связанных с мембранами специфических полипептидных ростовых факторов. Результаты многочисленных исследований свидетельствовали о том, что для выживания и пролиферации первичных половых клеток необходимо наличие в культуральной среде не только LIF, но и мембранносвязанных, а также растворимых Steel-факторов (SIF). Эти пептиды вырабатываются соматическими клетками зародышей, гомозиготных по мутации Steel, и один из них является лигандом протоонкогена cKit.

Первичные половые клетки млекопитающих и человека имеют внегонадное происхождение и являются источником клонального развития линии половых клеток. Начало линии первичных половых клеток, как и всем тканям эмбриона, а также внезародышевой мезодерме дает эпибласт (первичная эктодерма) ранних зародышей, имеющий мозаичную структурную организацию. Методом микрохирургического удаления различных частей раннего зародыша установлена зона локализации в эпибласте клона коммитированных предшественников первичных половых клеток. С помощью родаминдекстрана, который использовали в качестве клеточного маркера, установлено, что предшественники первичных половых клеток локализованы в проксимальной области эпибласта, рядом с внезародышевой эктодермой. Линия первичных половых клеток возникает из 45-клеточного клона, аллокация которого происходит в самом начале гаструляции. Затем наступает сегрегация клона, а в процессе гаструляции первичные половые клетки попадают во внезародышевую мезодерму и обнаруживаются в основании зачатка аллантоиса, позади от первичной полоски. Оттуда первичные половые клетки мигрируют в направлении вентральной части энтодермы задней кишки и далее активно перемещаются по брыжейке, заселяя в конце миграции половые валики. В процессе миграции, а также в первые 2-3 дня локализации в зачатке гонад первичные половые клетки активно пролиферируют и проходят восемь репликативных циклов. Если в начале миграции насчитывается около 50 первичных половых клеток, то в половых валиках мышиных зародышей двенадцатидневного развития число первичных половых клеток превышает 25 000.

О функциональном сходстве ЭСК и первичных половых клеток свидетельствует полная интеграция последних в бластоцисту с замещением внутренней клеточной массы и последующим полноценным развитием зародыша, ткани которого состоят только из потомков первичных половых клеток. По другим свойствам мышиные первичные половые клетки также оказались идентичными ЭСК, проявляя способность дифференцироваться в самых разных направлениях, формировать in vitro эмбриоидные тельца, a in vivo образовывать тератомы при подкожном введении иммунодефицитным мышам, напоминающие спонтанные тератомы семенника у мышей линии 129/ter.

Установлено, что при добавлении в среду LIF, мембранносвязанного и растворимого SIF изолированные первичные половые клетки 8-дневных мышиных зародышей выживают и размножаются в культуре на протяжении 4 дней, однако затем погибают. Причем срок, когда в культуре наблюдается гибель первичных половых клеток, совпадает с той стадией развития мышиных зародышей (12,5-13,5 дня), когда в зачатках гонад женские первичные половые клетки вступают в мейоз, а в мужских первичных половых клетках блокируются митотические деления. Однако, если добавить к среде не только ростовые факторы LIF и SIF, но и FGF2, то первичные половые клетки продолжают пролиферироватъ, а в субкультурах образуются колонии клеток, способных размножаться даже после удаления из среды ростовых факторов (SIF и FGF). Такие клетки можно длительно культивировать на подложке эмбриональных фибробластов без добавления растворимого ростового фактора LIF. Именно эти стабильные клеточные линии, полученные из первичных половых клеток, и было предложено называть эмбриональными половыми клетками. Данный термин никак нельзя считать удачным, поскольку при культивировании EG-клеток невозможно получить эмбриональные половые клетки, способные осуществлять последующие этапы оогенеза или сперматогенеза. Это связано с тем, что EG-клеточные линии, хотя и происходят из первичных половых клеток, но, приобретая в культуре свойства эмбриональных плюрипотентных стволовых клеток, теряют способность коммитирования в герменативные линии. Иными словами, первичные половые клетки при культивировании утрачивают свойства предшественников гамет и трансформируются в ЭСК-подобные плюрипотентные клетки.

Замечено, что при введении иммунодефицитным мышам EG-клеток тератомы не возникают. Допускается, что потеря способности EG-клеток человека давать начало тератомам обусловлена тем, что эти линии не были созданы непосредственно из культивируемых первичных половых клеток, а получены из клеток, выделенных из эмбриоидных телец. Поэтому не исключено, что они являются потомками хотя и плюрипотентных, но уже коммитированных клеток.

Следует отметить, что между EG-клетками и первичными половыми клетками существуют принципиальные различия. Последние не дают возможности получить химерные зародыши мыши, что свидетельствует об отсутствии способности первичных половых клеток интегрироваться в состав внутренней клеточной массы или трофэктодермы. Характеристики популяции первичных половых клеток скорее схожи с коммитированными линиями соматических клеток более поздних эмбрионов, введение которых в бластоцисту также не приводит к образованию химерных зародышей.

Модификация техники культивирования эмбриоидных телец, полученных при агрегации EG-клеток, позволила с помощью отбора на селективных средах получить еще одну популяцию плюрипотентных клеток, названных “клетками, полученными из эмбриоидных телец(embryoid body derived cells - EBD-клетки). Способность EBD-клеток длительно размножаться в культуре позволила создать стабильные клеточные линии коммитированных клеток. Были получены клоны клеток, экспрессирующие широкий спектр мРНК и белков-маркеров специализированных клеток. Этот подход в результате доказал, что первичные половые клетки человека плюрипотентны и дифференцируются in vitro в разные типы клеток: в нейроны, нейроглию, эндотелий сосудов, гемопоэтические клетки, мышечные и энтодермальные клетки.

Альтернативные источники эмбриональных стволовых клеток

Альтернативным источником линий ЭСК человека могут быть гибридные клетки. Имплантация в матку псевдобеременных коров гетерогеномной конструкции, полученной при слиянии с помощью электропорации соматических клеток фетуса человека с яйцеклеткой коровы, из которой предварительно удаляется пронуклеус, дает возможность получить внутреннюю клеточную массу из искусственного зародыша доимплантационных стадий развития. Для этого на первом этапе получают бластоцисту из яйцеклетки коровы с пересаженным ядром клетки человека.

На втором этапе из бластоцисты выделяют эмбриобласт, а из него - ЭСК по методу Томсона. Примечательно, что наилучшие результаты по выделению линий ЭСК с помощью данного метода были получены при использовании ядер фолликулярных клеток или первичных половых клеток, сохраняющихся в организме человека в состоянии гибернации. Это связано с тем, что пересаживаемые в яйцеклетку коровы ядра клеток человека должны иметь неукороченные теломеры и высокую активность теломеазы, что позволяет избежать преждевременного старения клонов ЭСК, получаемых из гибридной яйцеклетки (Репин, 2001). Известно, что наиболее важными внутриклеточными маркерными белками ЭСК являются Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, которые принадлежат к так называемым белкам-сайленсерам хроматина. Сайленсеры обеспечивают особо компактную упаковку гетерохроматина, что препятствует образованию петель эухроматина. Опосредованная этими белками упаковка хроматина коррелирует с тотипотентностью генома ЭСК. На сегодняшний день установлено, что зрелые яйцеклетки крупного рогатого скота и человека являются единственным видом специализированных клеток, содержащих высокие концентрации белков-сайленсеров в цитоплазме. На этом основании и был разработан метод получения гибридных ЭСК путем переноса ядер соматических клеток в безъядерные яйцеклетки коров. Предварительные исследования in vitro показали, что цитоплазма яйцеклеток коров восстанавливает тотипотентность генома ядер соматических клеток человека через 12-24 часа культивирования.

Определенный интерес представляют данные об особенностях доимплантационного развития зародышей человека, свидетельствующие о более позднем, чем у мышей, замещении тотипотентных клеток популяцией плюрипотентных клеток. Исследование клеточных преобразований показало, что из клеток внутренней клеточной массы бластоцист человека, помимо ЭСК, возникают и клетки трофобласта, что указывает на их тотальную потентность.

Известно, что на стадии бластоцисты возникают две по-разному коммитированные популяции клеток. Одна из них составляет наружный слой бластоцисты - трофэктодерму, производными которой являются клетки трофобласта и другие зародышевые компоненты плаценты. Вторая популяция клеток сгруппирована в плотную массу, контактирующую с внутренней поверхностью трофэктодермы. Производными популяции клеток внутренней клеточной массы выступают все ткани и зачатки органов зародыша. На стадии поздней бластоцисты из внутренней клеточной массы формируется внезародышевая энтодерма и образуется эпибласт (первичная эктодерма). При этом клетки эпибласта сохраняют плюрипотентность, тогда как способности к дифференцировке клеток внезародышевой энтодермы ограничиваются.

Получение эмбриональных стволовых клеток человека

До недавнего времени считалось, что получить из трофобласта ЭСК невозможно. Однако линия диплоидных стволовых клеток трофэктодермы, выделенная из бластоцисты, в среде, где вместо LIF содержится FGF2 и гепарин, пролиферирует и трансформируется в стволовые клетки. Если удалить из среды FGF2, то клетки трофэктодермы прекращают размножение, в них начинается эндоредупликация хромосом, и трофэктодермальные клеточные элементы постепенно преобразуются в гигантские клетки трофобласта. Вероятно, LIF не стимулирует пролиферацию клеток трофэктодермы вследствие того, что FGF2 запускает иной механизм транссигнализации, поскольку FGF2, связываясь с плазматическим рецептором (FGFR2), активирует в цитоплазме МАР-киназы - ERK1 и ERK2. Следовательно, при включении в клетках бластоцисты одного сигнального пути (LIF - gpl30 - JAK-киназы - STAT3) клетки внутренней клеточной массы трансформируются в плюрипотентные ЭСК, а при активации второго механизма трансмембранной передачи сигнала (FGF2 - FGFR2 - МАР-киназы ERK1/ERK2) в бластоцисте образуются стволовые клетки трофэктодермы. Выбор сигнального пути, в свою очередь, зависит от активности гена oct4. Этот ген, принадлежащий домену POU, расположен в локусе t аутосомы 17 и экспрессируется в процессе оогенеза, в период дробления, а также в клетках внутренней клеточной массы бластоцисты и в первичных половых клетках. Функциональная роль гена oct4 заключается в кодировке транскрипционного фактора, необходимого для возникновения плюрипотентных клеток, их дифференцировки и дедифференциации.

Экспрессия гена oct4 в ЭСК изменяется в зависимости от взаимодействия этого транскрипционного фактора с кофакторами. Направленная регуляция экспрессии oct4 в бластоцистах показала, что при снижении его активности половина клеток образует трофэктодерму, тогда как при повышении индуцированной экспрессии oct4 возникают преимущественно ЭСК.

В эксперименте ЭСК не удается перевести в линию при культивировании тотипотентных бластомеров на стадии дробления, а также на стадии гаструляции и более поздних стадиях эмбрионального развития. Мышиные ЭСК обычно выделяют на 3,5-4,5-й день беременности, что соответствует шестой (однослойная бластоциста) и седьмой стадиям (двухслойная бластоциста - ранний яйцевой цилиндр) нормального эмбриогенеза. Очевидно, что только в доимплантационном периоде зародыши мышей содержат клеточные популяции, способные трансформироваться в ЭСК. Следовательно, выделение линий ЭСК возможно лишь на определенных стадиях эмбриогенеза. Тотипотентными, с точки зрения возможности развития жизнеспособного эмбриона с зародышевыми оболочками и плацентой, являются зигота и возникающие в ходе дробления бластомеры. Утрата тотальной потенции зародышевых клеток начинается на стадии поздней морулы, когда дальнейшее коммитирование бластомеров зависит от их расположения. Бластомеры ранней морулы сохраняют тотипотентность, поскольку экспериментальные манипуляции с изменением их локализации, например инверсия их расположения, не препятствует развитию полноценного зародыша.

Установлено, что на эффективность выделения ЭСК в линию влияет состояние бластоцист в момент их эксплантации. Использование бластоцист после моделирования семидневной диапаузы в половом тракте мышей, овариоэктомированных на 3,5-й день беременности и получавших прогестерон, способствует более успешному выделению линий стволовых эмбриональных клеток. Предполагается, что в таких условиях увеличивается число бластомеров, образующих внутреннюю клеточную массу. Не исключено также, что происходит удлинение клеточного цикла и большинство бластомеров переходит в фазу G0.

Кроме того, создание стабильных плюрипотентных линий ЭСК зависит от генотипа зародышей: достаточно легко ЭСК выделяются из бластоцист мышиной линии 129, значительно трудней их получить при использовании мышей CS7BL/6 и практически невозможно выделить линию ЭСК из бластоцист мышей СВА/Са. Очевидно, ранние зародыши обладают какими-то генетическими особенностями, влияющими на развитие линии плюрипотентных ЭСК. Тем не менее, при культивировании изолированного эпибласта, а также с помощью селективного отбора дифференцирующихся клеток линии ЭСК из ранних зародышей мышей СВА/Са все же были выделены.

Отработанная стандартная техника получения линий ЭСК из бластоцист приведена в лабораторных пособиях по технике эксперимента с ранними зародышами. Экспериментальные линии ЭСК можно получить и при культивировании изолированного эпибласта (первичной эктодермы) 4,5-дневных мышиных зародышей с помощью довольно сложной микрохирургической техники и модифицированных условий культивирования. Трудоемкость этой процедуры оправдана, поскольку частота образования линий ЭСК при этом оказалась значительно выше, чем в работах с внутренней клеточной массой бластоцисты.

Для выделения линий ЭСК каждый клон переносят в микро-лунку, выращивают агрегат из 40-60 клеток, вновь его диспергируют. Многократное повторение такой процедуры позволяет получить иммортализованную линию ЭСК с максимальной скоростью пролиферации нормокариотипных клеток, прикрепленных к пластику, которые через 50-100 пассажей сохраняют тотипотентность и высокую активность теломеразы. В процессе поддержки линий ЭСК наибольшую опасность представляет загрязнение среды или сыворотки бактериальными эндотоксинами - даже следовые концентрации эндотоксина в среде культивирования вызывают массовую гибель незрелых зародышевых клеток. При тщательном контроле за линейным ростом и своевременном диспергировании ЭСК в культуре способны к симметричному делению, при котором обе дочерние клетки остаются плюрипотентными и способными осуществлять неограниченное количество клеточных циклов, сохраняя диплоидный кариотип и тотальную потентность.

Селекцию чистой популяции ЭСК человека можно проводить после трансфекции в их геном рекомбинантных молекул ДНК, содержащих ген, кодирующий синтез зеленого флуоресцентного белка (GFP). Экспрессия GFP увеличивается при выращивании ЭСК в условиях, поддерживающих их пролиферацию, тогда как с началом дифференцировки уровень экспрессии этого гена снижается, что позволяет отбирать на селективной среде чистые стабильные плюрипотентные клеточные линии. При культивировании выделенных с помощью GFP-селекции ЭСК частота образования колоний во много раз возрастает, поскольку в условиях селекционных культур устраняется мощный антипролиферативный эффект дифференцированных клеток.

Перевод эмбриональных стволовых клеток человека в линию осуществляется с помощью метода их выделения из доимплантационных зародышей (на стадии 80-120 клеток), которые остаются после процедуры оплодотворения in vitro. Для этого искусственно полученные “избыточные“ зародыши механически диспергируются в среде Дельбекко-Игла. После маркировки клеток селективными моноклональными антителами с флюоресцентной меткой изолируются клетки эмбриобласта. Эмбриобласт диспергируется на отдельные клетки с помощью смеси диспазы-коллагеназы. Диссоциированные клетки выращиваются в специальной среде (80% среды Дельбекко +20% фетальной телячьей сыворотки в присутствии 500 мкг/мл IL-6, LIF и SCF) над фидерным монослоем эмбриональных фибробластов первых 3 пассажей. При этом выживаемость и пролиферация стволовых и прогениторных клеток поддерживается за счет воздействия на них IL-6, LIF и SCF. В такой среде ЭСК растут суспензионными клонами неприкрепленных ошаренных клеток, которые необходимо диссоциировать мягким многократным пипетированием. Новые клоны возникают в суспендированной культуре на 5-7-е сутки. Максимальная скорость роста ЭСК достигается повторным диссоциированием клонов на стадии 10-15 клеток. Затем каждый клон переносят в микроячейку и выращивают до агрегата из 40-50 клеток. Процедуру повторяют многократно в пассажах, увеличивая объем культуры до плотности 5-10 млн клеток на 6-сантиметровую чашку. С помощью такого пассирования Томсоном было изолировано 10 бессмертных клонов ЭСК человека, которые через 100 пассажей сохраняли высокую активность теломеразы, способность к интенсивной пролиферации, минимальные фенотипические характеристики и тотальную потентность с возможностью дифференцировки в любую из 350 специализированных клеточных линий, являющихся производными экто-, мезо- и энтодермы. Дифференцировка ЭСК человека начиналась (при смене среды, добавлении сыворотки и элиминации LIF) с прикрепления клеток к подложке, что свидетельствует о развитии цитоскелета и экспрессии рецепторов адгезии. Важно, что при неограниченной пролиферации ЭСК человека сохраняли нормальный кариотип.

Второй метод выделения линий ЭСК человека основан на использовании первичных половых клеток. Экспериментальные исследования показали, что линии Ей-клеток можно получить из половых валиков 12,5-дневных эмбрионов мышей. Однако в этих случаях частота образования прогениторных клеточных линий была значительно ниже, чем в опытах с более ранними зародышами. При этом первичные половые клетки из гонад мышиных зародышей 13,5-дневного гестационного возраста вообще не способны трансформироваться в линии.

Первые стабильные линии плюрипотентных ЕG-клеток человека были получены из первичных гоноцитов, выделенных из половых зачатков 5-9-недельных эмбрионов. Изолированные клетки культивировали на подложке инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в среде DМЕМ с фетальной сывороткой, к которой добавляли меркаптоэтанол, форсколин, а также рекомбинантные ростовые факторы человека (FGF и LIF). Через 7-12 дней в культуре появились многоклеточные колонии, по морфологическим признакам и молекулярным маркерам соответствующие ЕG-клеткам человека. После агрегации эти клетки формировали эмбриоидные тельца, при дальнейшем развитии которых появлялись специализированные клетки, характерные для производных всех трех зародышевых листков. На протяжении 10-20 пассажей EG-клеточные линии сохраняли нормальный кариотип и не теряли плюрипотентности.

Показано также, что сочетанное действие LIF, мембранно-связанного и растворимого факторов Steel, а также TGF-b изменяет программу развития первичных половых клеток. Вместо того чтобы прекратить митотические деления и начать дифференцироваться в направлении оогенеза или сперматогенеза, первичные половые клетки продолжают пролиферировать. После осуществления нескольких дополнительных митотических циклов они становятся схожими с клетками эпибласта и, теряя свойства предшественников половых клеток, преобразуются в плюрипотентные эмбриональные стволовые EG-клетки.

Таким образом, в 1998 году из полового зачатка фетальной аутопсийной ткани человека впервые были выделены иммортализованные линии первичных половых клеток. В эмбриогенезе человека первичные половые клетки появляются в желточном мешке на 3-й неделе развития, а на 4-5-й неделях эти клетки мигрируют в зону полового бугорка, где образуют дормантные популяции первичных гоноцитов. В неактивном состоянии первичные половые клетки сохраняются в зародыше вплоть до рождения. Линии первичных половых клеток выделяются из фетального полового бугорка 5-9-недельных эмбрионов, извлеченную ткань которого ex tempore обрабатывают смесью коллагеназ IV-V типов, гиалуронидазы и ДНКазы для повышения количественно-качественного выхода клеток. Первичные половые клетки в ткани фетального полового бугорка окружены стромальными (мезенхимальными) клетками Сертоли. Функциональное предназначение клеток Сертоли заключается в продукции антиапоптозных факторов (Fas-лиганд), митогенов, а также иммуносупрессоров, защищающих половые стволовые клетки от иммунной атаки со стороны организма. Кроме того, стромальное микроокружение полового бугорка играет важную роль в созревании гамет. Выделенные первичные половые клетки высаживают в культуру над фидерным стромальным слоем, состоящим из фетальных фибробластов первых трех пассажей. Наиболее эффективной комбинацией митогенов признан комплекс, состоящий из LIF, FGF и форсколина (стимулятор образования цАМФ). Пролиферация первичных половых клеток in vitro требует добавления фетальной сыворотки, в присутствии которой размножение первичных гоноцитов в культуре сопровождается образованием клонов шаровидных, неприкрепленных к подложке клеток.

В Национальном институте здоровья США на основании обобщения существующих сведений о методах выделения линий ЭСК человека из бластоцисты было сделано предварительное заключение о том, что успешное выделение ЭСК наиболее вероятно при культивировании бластоцист с хорошо сформированной внутренней клеточной массой (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). С этой точки зрения, оптимальным источником ЭСК для создания линий являются бластоцисты человека 5-го дня развития, из которых при выделении внутренней клеточной массы следует тщательно удалять трофэктодерму. Изолированную внутреннюю клеточную массу, состоящую на этой стадии из 30-35 клеток, необходимо культивировать на подложке эмбриональных мышиных фибробластов, что является решающим условием для образования в культуре колоний ЭСК.

Fнализ фенотипических особенностей эмбриональных стволовых клеток

Определенный интерес представляет межвидовой сравнительный анализ фенотипических особенностей ЭСК. Установлено, что колонии ЭСК человека - это плотные скопления уплощенных, эпителиоподобных клеток, тогда как эмбриоидные тельца мышей состоят из рыхлого конгломерата округлых клеток. В ЭСК человека индекс ядерно-плазматического соотношения ниже, чем в мышиных ЭСК. Эмбриональные стволовые клетки обезьян формируют более плоские колонии клеток с неровными краями. В ранних клонах ЭСК приматов легко просматриваются отдельные клетки. Пролиферирующие ЭСК всех изученных видов животных не экспрессируют молекулы МНС I и II классов. В то же время ЭСК человека дают позитивную реакцию на антитела TERA 1-60 и GCTM-2, что свидетельствует о наличии на их поверхности кератин/хондроитинсульфатных протеогликанов, характерных для эмбрио-(терато)-карциномных стволовых клеток. Экспрессия в ЭСК всех видов животных гена oct4 позволяет предположить, что, несмотря на фенотипические различия, в ЭСК человека и мыши, по-видимому, активируется один и тот же набор генов, отвечающий за сохранение плюрипотентности (Peru, 2001). Кроме того, линии ЭСК, выделенные из эмбрионов крыс, свиней, кроликов, приматов и крупного рогатого скота, имеют подобные морфологические характеристики, схожий набор молекулярных идентификационных маркеров и почти идентичный молекулярный механизм для реализации программ эмбриогенеза, что позволяет по-новому взглянуть на проблему ксенотрансплантации.

В отличие от нормального эмбриогенеза in vivo, пролиферация ЭСК in vitro не сопровождается образованием зародышевых листков и протекает на фоне блокировки гомеозисных Нохгенов, то есть, без органогенеза. Поскольку гены сегментации не функционируют, в культуре ЭСК невозможно воспроизвести такие периоды эмбриогенеза, как закладка сомитов, сегментация зародыша, формирование желточного мешка, аллантоиса и других провизорных органов и тканей. Культуральные ЭСК как бы застыли в начале процесса образования 350 рестрикционных линий специализированных клеток. Таким образом, клон дочерних прогениторных клеток и центрально локализованная ЭСК представляют собой лишь модель эмбриона, в процессе развития которого в разных тканевых регионах одномоментно формируются разные линии специализированных клеток, происходящих, тем не менее, из общих предшественников. Несмотря на минимальный уровень рецепторов на поверхности ЭСК, они сохраняют способность осуществлять примитивные формообразовательные процессы, имитируя объемные структуры раннего зародыша: взвесь ЭСК в культуре агрегирует и образует структуры, напоминающие бластоцисты или даже более поздние зародыши (яйцевые цилиндры). Такие суспензионные агрегаты соответственно получили название простых и сложных эмбриоидных телец.

При смешанной дифференцировке в разных клетках одного эмбриоидного тельца одновременно экспрессируются ранние гены эктодермы (oct3, fgf-5, nodal), энтодермы (gata-4), мезодермы (brachyury), кардиогенной мезодермы (пкх-2,5), нейральной трубки (msx3) и кроветворения (elkf). С помощью различных комбинаций ростовых факторов и цитокинов для направленного воздействия на формирование клеток зародышевых листков in vitro в ряде случаев удалось получить эмбриоидные тельца, в которых предпочтительно были экспрессированы гены эктодермы или мезодермы, что открывает путь к моделированию гаструляции и начальных фаз органогенеза.

Клональный рост ЭСК является свидетельством асимметричного деления клеток, при котором лишь одна из ЭСК в центре клона сохраняет нелимитированный потенциал размножения, в то время как вторая дочерняя клетка порождает поколение прогениторных клеток, уже выходящих в дифференцировку. Поэтому скорость размножения клона на периферии эмбриоидного тельца выше, чем в центре. Краевые клетки растущего клона подвергаются спонтанной неупорядоченной дифференцировке, мигрируют или погибают по механизмам апоптоза. Эти события определяют судьбу клона: если скорость пролиферации превышает скорость миграции и апоптотической гибели клеток, размеры клона продолжают увеличиваться, стабилизация наступает при равенстве скорости апоптоза и скорости образования новых клеток, регресс - при обратном соотношении этих процессов. Прогениторные клетки делятся симметрично, то есть, обе дочерние клетки в дальнейшем дифференцируются в зрелые специализированные клеточные линии. Соотношение ЭСК/прогениторные клетки варьирует, однако всегда количество ЭСК составляет лишь доли процента от популяции прогениторных клеток. Поэтому только тщательное пипетирование и своевременная дезагрегация клонов способны увеличить число ЭСК в культуре. Для получения максимального выхода ЭСК наиболее эффективной оказалась дезагрегация клонов на стадии 10-12 клеток. Направление и степень дифференцировки клеток в эмбриоидном тельце зависят от их расположения. Наружные клетки эмбриоидного тельца не экспрессируют ген oct4 и подвергаются дифференциации в клетки первичной энтодермы, из которых в дальнейшем образуются эпителиоподобные клетки париетальной и висцеральной внезародышевой энтодермы. Внутренние клетки эмбриоидного тельца экспрессируют ген oct4 и сохраняют плюрипотентность в течение 48 часов культивирования. Однако затем происходит морфологическая перестройка культуры в эпителиальный монослой и начинается экспрессия генов, контролирующих развитие первичной эктодермы. Далее начинается процесс тотальной неупорядоченной цитодифференцировки с появлением различных клеточных типов, являющихся производными всех трех зародышевых листков. В процессе спонтанной дифференцировки клеток эмбриоидного тельца первыми возникают агрегаты с маркерами энтодермы в виде фрагментов (цист) желточного мешка. Далее в этих структурах появляются ангиобласты и клетки эндотелия растущих капилляров. На завершающих этапах спонтанной дифференцировки из внутренних клеток эмбриоидного тельца развиваются разнообразные терминально дифференцированные клетки, включая нейроны, глиальные элементы, кардиомиоциты, макрофаги и эритроциты. В определенном приближении (учитывая пространственную инверсию формирования листков зародышевой ткани), с помощью эмбриоидных телец можно in vitro исследовать морфогенетические процессы и анализировать молекулярные механизмы начальных периодов эмбриональной цитодифференцировки, а также установить роль конкретных генов в реализации этих процессов.

Таким образом, в пределах клона находятся клетки, в которых открыты разные генетические программы развития - ЭСК, ранние прогениторы и дифференцирующиеся прогениторные популяции. Культивирование ЭСК методами висячей капли или массовой культуры без фидерного слоя и без добавления в среду LIF неизбежно приводит к формированию эмбриоидных телец. Морфология клеток наружного и внутреннего слоев эмбриоидных телец отличается. Внешний слой состоит из крупных, отростчатых клеток. Их поверхность, обращенная к окружающей среде, покрыта многочисленными микроворсинками. Наружный слой клеток отделен от внутреннего базальной мембраной, напоминающей мембрану Рейхерта, тогда как клетки внутреннего слоя эмбриоидных телец представляют собой цилиндрический эпителий. Морфологически внутренний слой, хотя и содержит много делящихся клеток, больше напоминает недифференцированные колонии ЭСК.

Особенности эмбриональных стволовых клеток человека

Отсутствие паренхиматозно-мезенхимальных сигнальных взаимодействий на фоне блокировки генов гомеозиса приводит к неупорядоченному росту ЭСК в культуре, так как при этом нарушается закладка и формирование инфраструктуры провизорных органов. Неорганизованный рост и беспорядочная спонтанная дифференцировка ЭСК в культуре обусловлены отсутствием мезенхимальной разметки стромального каркаса будущих органов: in vitro вполне возможно формирование миллионов гепатоцитов, но нельзя получить ни одной дольки печени, включающей такие структурно-функциональные элементы, как синусы, пространства Диссе и клетки Купфера.

Считается, что плюрипотентность ЭСК реализуется исключительно в эмбриогенез с образованием тканей и органов зародыша, тогда как плацента и пуповина являются производными трофобласта. Заключенные в трофэктодермальную оболочку ЭСК последовательно генерируют клоны провизорных клеток, реализующих программу развития посредством комбинаторики мРНК по объемной топографической матрице Нохтеяов, которые предопределяют пространственное расположение, форму и размеры, число клеток провизорных и дефинитивных органов, а также сборку паренхимы в структурно-функциональные единицы. При этом ЭСК остаются единственным типом клеток, в которых молекулярный механизм реализации их потенций абсолютно разобщен с генетической программой развития, а сами ЭСК лишены возможности взаимодействия с другими клетками из-за блокировки как рецепторных восприятий, так и систем транссигнализации. Однако адекватная активация ЭСК приводит к поэтапному развертыванию программы эмбриогенеза, заканчивающейся рождением полностью сформированного и готового к внеутробной жизни организма, состоящего из миллиардов клеток. На этом коротком во времени, но невообразимо долгом в клеточном пространстве пути неизбежно возникновение ошибок как в молекулярных механизмах, обеспечивающих жизнедеятельность клеток, так и в программах, контролирующих их пролиферацию, дифференцировку и специализацию. Поэтому в современной фармакогеномике отдельно рассматриваются болезни молекулярного устройства и болезни программирования клеток. Причем действие большинства новых лекарственных средств направлено на коррекцию именно программ дифференцировки, пролиферации и органогенеза, а также регенерации органов и тканей. Во взрослом организме с помощью ЭСК становится возможным управлять поведением стволовых/прогениторных клеток, трансплантируемых в мозг, печень, селезенку, костный мозг и другие органы человека для восстановления поврежденной паренхимы органов реципиента за счет дифференцировки и специализации донорских клеток на сохранившейся мезенхимальной матрице. По существу, программа тотипотентности начинает реализацию еще на уровне геномов ооцита, зиготы и бластомер, однако эти клетки пока не удается клонировать и пассировать в количествах, необходимых для нужд експериментальной и практической медицины. Поэтому ЭСК остается уникальным источником генетической информации, содержащей коды трехмерной карты зародыша и коды линейной рестрикции специализированных клеточных линий в период гаструляции.

Практически безграничные регенеративные возможности ЭСК обусловлены тем, что их геном, в отличие от генетического аппарата дифференцированных соматических клеток, сохраняет плюрипотентность. Одним из проявлений дормантного состояния заложенной в ЭСК генетической информации является так называемый минимальный фенотип - на поверхности ЭСК экспрессировано ограниченное число рецепторов, и, соответственно, развернуто крайне мало программ транссигнализации для взаимодействия ядерного аппарата клетки с ее микроокружением. На фоне гибернации генов, ответственных за рестрикцию специализированных клеточных линий и дифференцировку клеток, активировано всего около 30 из 500 генов, продукты которых обеспечивают связь клетки с окружающей микросредой. С помощью метода серийного анализа генной экспрессии показано, что при общности работы главных функциональных боксов генома, регулирующих энергетику и метаболизм в соматических клетках и ЭСК, в последних определяется весьма низкий уровень мРНК рецепторов, G-белков, вторичных мессенджеров, транскриптаз, кофакторов экспрессии и репрессии, то есть, всей системы трансмембранной передачи регуляторного сигнала в клетку. Это связано с отсутствием или очень низкой экспрессией генов транссигнализации. В период индуцированной дифференцировки в геноме ЭСК синхронно прекращают работу 18 функционирующих генов на фоне активации 61 гена транссигнализации, контролирующих синтез рецепторов клеточной адгезии, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, рестрикционных транскриптаз и мессенджерных элементов системы передачи сигнала на ядерный аппарат с рецепторов плазматической мембраны клеток. Одновременно блокируется экспрессия генов, ответственных за синтез белков-сайленсеров, а также коингибиторов генной экспрессии, обеспечивающих тотипотентность генома ЭСК.

Для клеток всех трех зародышевых листков найдены генные маркеры. Идентификация эктодермального слоя клеток проводится по экспрессии генов nodal, oct3 и fgf-5, клеток мезодермы - генов brachyury, zeta-globin, энтодермы - по экспрессии гена gata-4. В нормальном эмбриогенезе в период гаструляции наблюдается активная миграция незрелых популяций стволовых и прогениторных клеток, локально обозначающих зоны развития костей лицевой части черепа, некоторых отделов головного мозга, периферической нервной системы, проводящей системы сердца и тимуса, ткани которых формируются из клонов клеток-переселенцев. Маркировка клеток по ранним генам зародышевых листков облегчает задачу топографического анализа процессов миграции клеток-предшественников в развивающемся эмбрионе. Установлено, в частности, что в агрегатах клеток эмбриокарциномы Р19 экспрессия первого гена мезодермы brachyury начинается в период снижения экспрессии генов тканевого активатора плазминогена, а-фетопротеина, кератина 8 и кератина 19, которые являются маркерами первых мигрирующих популяций мезодермы. Следовательно, формирование тканей мезодермального происхождения начинается только после завершения процесса точечной миграции и расселения мезодермальных клеток-предшественников.

При крайне ограниченных фенотипических признаках и отсутствии большинства блоков транссигнализации ЭСК все же экспрессируют некоторые рецепторные молекулы, которые можно использовать для их идентификации. Примечательно, что антигены-маркеры ЭСК у человека и приматов оказались общими. Чаше всего для маркировки ЭСК используют меченые антитела к мембранносвязанным антигенам SSEA-3, SSEA-4 (уникальные липидные антигены, представляющие комплекс гликолипида GL7 с сиаловой кислотой), а также высокополимерные гликопротеиды TRA-1-81, TRA-1-60. Кроме того, ЭСК экспрессируют специфический эмбриональный антиген SSEA-1 и эндогенную щелочную фосфатазу, а также специфический транскрипционный фактор Oct4. Последний необходим для поддержания механизмов пролиферации ЭСК - специфический транскрипционный фактор Oct4 активирует экспрессию гена фактора роста фибробластов 4 и стабилизирует экспрессию бокса генов, ответственных за нелимитированную редупликацию ДНК в незрелых клетках. Наиболее важными внутриклеточными маркерными белками являются Oct3, Oct4, Tcf и Groucho, относящиеся к белкам-сайленсерам хроматина.

Практически сразу после того как многолетние попытки культивировать ЭСК вне организма увенчались успехом и были получены первые культуры стволовых клеток, выделенных из бластоцист мыши, а также культуры первичных половых клеток, начался этап исследований плюрипотентного потенциала ЭСК при их введении в эмбрионы на ранних стадиях развития. Было показано, что на стадии морулы и бластоцисты ЭСК способны формировать химерные зародыши, в которых потомки донорских ЭСК выявляются во всех соматических тканях и даже в гаметах. Таким образом, в биологии развития с помощью ЭСК был установлен “мост” между экспериментальными исследованиями in vivo и in vitro, что значительно расширило возможности изучения процессов закладки первичных тканей и органов, их дифференцировки и эмбрионального органогенеза.

Четко установлено, что in vivo в процессе эмбриогенеза ЭСК интегрируются в клеточную массу раннего зародыша, а их производные обнаруживаются во всех органах и тканях. ЭСК колонизируют в химерном зародыше линию половых клеток, потомки которых образуют полноценные яйцеклетки и спермии. Эмбриональные стволовые клетки клоногенны - единичная ЭСК способна создать генетически идентичную колонию клеток с молекулярными маркерами, к которым относится экспрессия гена oct4 и щелочной фосфатазы, высокая активность теломеразы, а также экспрессия определенных эмбриональных антигенов.

Для изучения механизмов эмбриогенеза с помощью ЭСК разработана методика химеризации морулы путем создания биологической конструкции, снаружи которой располагается слой тетраплоидных бластомеров реципиента, а внутрь вводятся донорские ЭСК. Таким образом, трофобласт формируется из потомков тетраплоидных бластомеров реципиента, что обеспечивает имплантацию и плацентацию, а донорские ЭСК выступают в роли внутренней клеточной массы, из которой образуется тело жизнеспособного зародыша и линия первичных прогениторных половых клеток. Исследовательская ценность ЭСК заключается не только в том, что при манипуляциях in vitro с их геномом сохраняется плюрипотентность, но и в том, что при этом сберегается способность ЭСК участвовать в образовании первичных половых клеток химерного зародыша. Показано, что потомки всего одной генетически модифицированной ЭСК заселяют все первичные зачатки и формирующиеся ткани химерного эмбриона, полученного посредством агрегации или кокультивирования этой клетки с 8-клеточным зародышем. При трансплантации в морулу мышей ЭСК, трансфецированных геном зеленого флуоресцентного протеина, флуоресцирующие потомки этой клетки были обнаружены во всех исследуемых тканях развивающегося эмбриона (Shimada, 1999). Трансплантация ЭСК в морулу позволяет создавать жизнеспособных мышей, организм которых состоит только из потомков донорской ЭСК, что открывает перспективы для различных вариантов терапевтического клонирования. Сейчас такой методический подход успешно применяется для изучения проблем биологии развития, в частности, с его помощью проводят анализ механизмов генетической инактивации Х-хромосомы или эпигенетической нестабильности ЭСК. Трансплантация ЭСК в ранний зародыш используется и в биотехнологиях сельского хозяйства, а также в экспериментах по генотерапии.

Пересадки генетически модифицированных ЭСК применяются для тестирования клеток-мишеней мутантных генов. Культивируемые in vitro ЭСК используются в биотехнологиях по созданию нокаутных мышей. Для этого посредством гомологичной рекомбинации из ЭСК удаляют подлежащий исследованию ген (нокаут) и на селективных средах выделяют клетки, лишенные этого гена. Затем нокаутные ЭСК вводят в бластоцисту или проводят их агрегацию с бластомерами морулы. Полученные таким образом химерные ранние зародыши трансплантируют самкам-реципиентам, и среди новорожденных мышей отбирают особей с гаметами, нуллизиготными по данному гену. По этой технологии создано множество линий нокаутных мышей, которые широко используются в экспериментальной биологии и экспериментальной медицине. На таких биологических моделях изучается значение тех или иных генов в эмбриональном развитии, а также их роль в механизмах заболеваний и патологических состояний человека. Кроме того, линии нокаутных животных применяются при проведении этапа доклинических испытаний новых способов генотерапии. Например, с помощью трансфекции в геном ЭСК нормального аллеля мутантного гена удается эффективно корригировать мутацию, поражающую систему кроветворения. Введение в ЭСК чужеродных генов позволяет ускоренными темпами создавать линии гомозиготных трансгенных лабораторных животных. Однако следует заметить, что техника направленной рекомбинационной делеции генов надежно отработана пока еще только относительно ЭСК мышей. С помощью мышиных ЭСК с двойным нокаутом установлена функциональная роль области скопления генов на 7-й хромосоме (копия геномного участка на 19-й хромосоме человека), а также проксимального участка 11-й хромосомы (копия 5д-хромосомы человека) - делеция данных генов в ЭСК мышей позволила оценить функцию их аналогов у человека.

Расширились возможности исследования функции генов эмбриогенеза человека, трансфекция которых в геном ЭСК лабораторных животных позволила, в частности, уточнить роль гена crypto в закладке и формировании кардиогенной мезодермы, гена рах-6 - в эмбриогенезе глаза. Составляются первые карты экспрессии генов в незрелых пролиферирующих ЭСК тератокарциномы и бластоцисты мышей, подтверждена подавляющая репрессия в ЭСК генов транссигнализации. Комбинация из 60-80 мутантных ЭСК и 20-30 клеток нормальных доимплантационных мышиных зародышей приводит к развитию химерных эмбрионов, у которых закладки органов состоят из донорских и реципиентных клеток, что позволяет выяснить роль неизвестных генов в гаструляции и органогенезе. Функциональную карту генов развивающихся зародышей мыши пополнили сведения о роли гена sf-1 в закладке надпочечника и половых зачатков, гена wt-1 - в закладке почки, генов семейства myoD - в закладке скелетной мышцы, генов семейства gata-1-4 - в рестрикционном созревании зачатков эритро- и лимфопоэза.

Направленное выключение материнского и отцовского аллелей генов в ЭСК с помощью векторных рекомбиназ позволило уточнить функции различных генов в раннем периоде эмбриогенеза, а технология направленного переноса неизвестных генов человека в ЭСК мыши способствует открытию новых мутантных генов, ответственных за развитие тяжелой наследственной патологии. С использованием нокаут-метода определено облигатное значение некоторых генов для закладки эмбриональных тканей: gata-4 - для миокарда, gata-1 - для эритроидного ростка кроветворной ткани, myoD - для скелетных мышц, brachyury - для мезодермы, рестрикционных транскриптаз hnf3 и hnf4 - для стволовых клеток печени, rag-2 - для закладки клонов Т- и В-лимфоцитов (Репин, 2001). Двойная делеция генов в ЭСК открыла доступ к изучению функциональной роли генов зародышевых листков, сегментации и гомеозиса, а трансплантация ЭСК дала возможность получения жизнеспособных межвидовых зародышей-гибридов. С помощью усовершенствованной методики трансплантации единственной донорской ЭСК в 8-клеточный зародыш доказан факт химеризации на клеточном уровне многих органов эмбриона-реципиента. Заметим, что клеточные ростки ткани человека обнаружены в органах мышей-реципиентов и после введения гемопоэтических стволовых клеток человека в бластоцисту. Установлено, что у мышиных зародышей в период формирования органов в крови циркулируют плюрипотентные ЭСК. Не исключено, что их биологическая функция заключается в эмбриональной организации будущей иммунной системы. С помощью ЭСК в лабораторных условиях воспроизведены адекватные модели генетической патологии человека: двойной нокаут гена дистрофина моделирует у мышей мышечную дистрофию Дюшенна, выключение гена atm (контроль синтеза сигнальной киназы хроматина) - атаксию-телеангэктазию. При этом фатальном наследственном заболевании у детей из-за дефектов репарации ДНК развивается дегенерация клеток Пуркинье в мозжечке, что сопровождается инволюцией тимуса вследствие гибели пролиферирующих клеток. Клиника, патофизиология и патоморфология атаксии-телеангэк- тазии, воспроизведенной с помощью привнесения в ЭСК патологической генетической информации, у мышей-химер соответствуют таковым у человека. Кроме атаксии-телеангэктазии с использованием ЭСК и нокаутных мышей разработаны экспериментальные модели некоторых наследственных гомозиготных заболеваний человека, связанных с патологией углеводного и липидного обмена, катаболизма аминокислот, выведения меди и билирубина, что значительно расширило возможности экспериментальной медицины на этапе доклинических испытаний новых способов лечения соответствующих болезней человека.

Использование цитогибридов стволовых клеток

Гибридные клетки, полученные путем слияния ЭСК с соматическими клетками, представляют собой адекватную и перспективную модель для изучения плюрипотентности стволовых клеток и репрограммирования хромосом дифференцированных клеток. Цитогибриды, полученные методом слияния ЭСК с дифференцированными клетками взрослого животного, дают возможность изучать взаимоотношения геномов разного “возраста": складывается уникальная ситуация, когда гомологичные хромосомы, происходящие из клеток разных стадий дифференцировки и разной степени зрелости, находятся в одном ядре, где они могут легко обмениваться трансдействующими регуляторными сигналами. Трудно предвидеть, как будут реагировать цисрегуляторные эпигенетические системы гомологичных хромосом, сложившиеся в ходе индивидуального развития, в ответ на влияние трансдействующих сигналов, исходящих от эмбриональных родственных геномов. Кроме того, в гибридных клетках происходит сегрегация родительских хромосом, что позволяет изучать взаимодействие геномов на уровне отдельных хромосом, то есть, потенциально идентифицировать участие конкретных хромосом в поддержании плюрипотентности или, наоборот, выхода в дифференцировку.

В качестве первой экспериментальной модели для изучения взаимодействия геномов с разной “историей развития” использовались цитогибриды, полученные при слиянии плюрипотентных тератокарциномных и дифференцированных соматических клеток. В некоторых случаях такие гибридные клетки сохраняли плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне. В частности, in vivo тератокарциномно-соматические гибридные клетки индуцировали развитие истинных тератом, содержащих дериваты всех трех зародышевых листков, a in vitro в суспензионных культурах формировали эмбриоидные тельца. Даже у межвидовых цитогибридов такого типа отмечалось наличие эмбриональных антигенов в тех случаях, когда соматическими партнерами в слиянии с клетками тератокарциномы были лимфоциты или тимоциты. Примечательно, что цитогибриды, созданные при слиянии тератокарциномных клеток с фибробластами, по фенотипу соответствовали фибробластам.

Наиболее важным установленным фактом является то, что в тератокарциномно-соматических гибридных клетках появлялись признаки репрограммирования генома дифференцированных клеток, что характеризовалось реактивацией либо отдельных генов, либо неактивной Х-хромосомы соматического партнера. Таким образом, результаты исследований на цитогибридах типа тератокарциномно-соматических клеток свидетельствуют о том, что в гибридных клетках нередко сохраняется плюрипотентность и имеются признаки репрограммирования генома соматического партнера.

В экспериментах по получению внутривидовых эмбриональных гибридных клеток путем слияния ЭСК мыши со спленоцитами взрослого животного изучена характеристика таких цитогибридов, проведен анализ сегрегации родительских хромосом и дана оценка плюрипотентности гибридного генома. Для внутривидовых гибридных клеток, полученных от слияния клеток тератокарциномы с соматическими клетками, обычно характерен низкий уровень сегрегации хромосом с тетраплоидным или околотетраплоидным кариотипом. Подобный хромосомный состав наблюдался в цитогибридах при слиянии первичных половых клеток с лимфоцитами. В то же время у межвидовых гибридных клеток, полученных в результате слияния мышиных тератокарциномных клеток с лимфоцитами норки, отмечалась интенсивная сегрегация хромосом соматического партнера.

Качественно новый этап исследования сегрегации родительских хромосом у внутривидовых гибридов наступил после разработки метода анализа микросателлитов с помощью полимеразной цепной реакции, благодаря которому на каждую хромосому мыши найдено несколько сотен маркеров, позволяющих надежно дискриминировать любую пару гомологичных хромосом в гибридных клетках.

Путем слияния ЭСК (использовались клетки НМ-1, дефицитные по активности гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, 2п = 40, XY, выделенные из бластоцист мышей линии 129/01а) со спленоцитами мышей конгенной линии DD/c удалось получить набор гибридных клонов, морфологически имевших сходство с ЭСК. Все клоны были выделены на селективной среде, в которой возможен рост только клеток с активной гипоксантинфосфорибозилтрансферазой. Электрофоретический анализ показал наличие у всех клонов аллельного варианта гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, характерного для мышей DD/c. С помощью цитогенетического анализа было установлено, что из четырех гибридных клонов три имели околодиплоидный набор хромосом. Один околотетраплоидный клон содержал две популяции гибридных клеток, одна из которых была тетраплоидной, а вторая, меньшая - диплоидной.

Анализ микросателлитов, позволяющий дискриминировать любую пару гомологичных хромосом мышей 129/01а и DD/c, в гибридных клонах с околодиплоидным набором показал, что в двух клонах произошла отчетливая преимущественная элиминация аутосом соматического партнера. Большинство аутосом в клонах HESS2 и HESS3 имели маркеры линии 129/01а, то есть, плюрипотентного партнера. Исключение составили хромосомы 1 и И: в клонах HESS2 и HESS3, наряду с маркерами НМ-1 клеток, в небольшом количестве присутствовали маркеры соматического партнера. Такие результаты могут отражать неполноту сегрегации хромосом 1 и И соматического партнера и согласуются с цитогенетическими данными о том, что трисомия по этим хромосомам наблюдается в 30-40% клеток клонов HESS2 и HESS3. Клон HESS4 существенно отличался по хромосомному составу: многие аутосомы в этом клоне происходили из генома ЭСК (хромосомы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), однако хромосомы 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 и 19 были представлены гомологами обоих родителей. Количественное соотношение микросателлитов, маркирующих эти гомологичные хромосомы, примерно соответствовало 1:1. Это позволило авторам предположить, что один гомолог имеет происхождение из генома ЭСК, а другой - из дифференцированных клеток. В некоторых субклонах клона HESS4 наблюдалось присутствие только маркеров хромосом 18 и 19 соматического партнера. Полученные результаты свидетельствуют, что в клетках клона HESS4, помимо сегрегации хромосом соматического партнера, произошла элиминация одного или обоих гомологов перечисленных выше хромосом плюрипотентного генома, то есть, имела место двусторонняя сегрегация хромосом обоих родителей - явление весьма необычное, поскольку для цитогибридов характерна сегрегация хромосом только одного из родителей.

Кроме того, после 20-го пассажа все клоны гибридных клеток содержали исключительно маркеры Х-хромосомы соматического партнера, то есть, в клонах произошла замена Х-хромосомы ЭСК на Х-хромосому соматического партнера. Подтверждают этот важнейший факт данные in situ гибридизации с использованием ФИТЦ-меченого зонда, специфичного для Х-хромосомы мыши: позитивный сигнал обнаруживался только на одной хромосоме. Следует отметить, что на более ранних сроках культивирования (до 15-го пассажа), согласно цитогенетическим данным, во многих клетках присутствовали две Х-хромосомы. Следовательно, использование селективных сред позволяет манипулировать хромосомным составом гибридных клеток и направленно отбирать клоны, несущие единичные хромосомы соматического партнера на фоне генома ЭСК.

Поскольку уникальной особенностью генома цитогибридов является локализация родительских геномов в одном ядре, естественно, возникает вопрос о сохранении плюрипотентных свойств эмбрионального генома в ЭСК-соматических клеточных гибридах в условиях его тесного контакта с геномом дифференцированной клетки. Морфологически цитогибриды ЭСК и соматических клеток имели сходство с родительской линией ЭСК. Оценка плюрипотентности показала, что все клоны с околодиплоидным набором хромосом были способны образовывать в суспензионных культурах эмбриоидные тельца, в которых присутствовали производные трех зародышевых листков.

Большинство гибридных клеток содержало антиген ЕСМА-7 - маркер, характерный для ранних эмбрионов мыши, а также обладало высокой активностью щелочной фосфатазы. Наиболее убедительные данные о высоких плюрипотентных свойствах гибридных клеток были получены в экспериментах по получению серии инъекционных химер с участием гибридных клеток клона HESS2. Анализ биохимических маркеров показал, что потомки донорских гибридных клеток находились в большинстве тканей химер. Следовательно, гибридные клетки, полученные путем слияния ЭСК и соматических дифференцированных клеток, сохраняют плюрипотентность на высоком уровне, включая способность формировать химеры при введении в полость бластоцисты.

Клоны HESS2 и HESS4 существенно различались по составу родительских хромосом, однако имели сходные плюрипотентные свойства. Можно было бы полагать, что плюрипотентноств' в гибридном геноме проявляет себя как признак доминантный, однако не исключено, что не все хромосомы эмбрионального генома вовлечены в процесс поддержания плюрипотентности. Если такое допущение справедливо, то можно ожидать, что элиминация некоторых хромосом плюрипотентного партнера из генома гибридных клеток не будет сопровождаться изменением их плюрипотентного статуса. В этом случае анализ сегрегации родительских хромосом в эмбриональных гибридных клетках позволил бы вплотную приблизиться к идентификации хромосом, ответственных за контроль плюрипотентности эмбриональных клеток.

О. Серов и соавторы (2001) не обнаружили среди 50 потомков, полученных при скрещивании химер с нормальными мышами, таких, которые имели бы генотип мышей 129/01а и несли Х-хромосому мышей DD. Авторы видят причину этого в снижении плюрипотентности в гибридных клетках под влиянием соматического генома. Альтернативным объяснением может быть негативное влияние трисомии по некоторым аутосомам и несбалансированность по половым хромосомам (XXY наблюдались в клетках до 15-го пассажа) в гибридных клетках при прохождении ими мейоза. Известно, что клетки XXY не в состоянии пройти мейоз и образовывать гаметы. Трисомия способна также вызвать снижение пролиферативной активности гибридных клеток, в результате чего селективное преимущество в развитии химер может принадлежать клеткам реципиентного эмбриона. Из этого следует, что для адекватной оценки плюрипотентного потенциала гибридных клеток необходимо получить гибридные клоны с нормальным диплоидным набором хромосом.

В экспериментах О. Серова и соавторов (2001) была впервые показана возможность репрограммирования Х-хромосомы соматической клетки в геноме гибридных клеток. Такой вывод авторов следует из анализа экспрессии у химер гена hprt (маркер Х-хромосомы): присутствие аллельного варианта hprt мышей DD/c было обнаружено во всех анализированных химерных тканях. Уместно подчеркнуть, что после введения гибридных клеток в полость бластоцисты цитогибриды попадают в неселективные условия и сохранение Х-хромосомы в геноме гибридных клеток означает, что она стала его облигатным компонентом и геном не дискриминирует ее от У-хромосомы плюрипотентного партнера.

Суммируя результаты анализа взаимодействия соматического и плюрипотентного геномов в гибридных эмбриональных клетках, авторы заключают, что в некоторых цитогибридах плюрипотентность проявляется как доминантный признак. Гибридный геном способен перепрограммировать индивидуальные хромосомы дифференцированных клеток, что, однако, не исключает возможности обратного влияния соматического генома на плюрипотентность эмбрионального генома. При культивировании гибридных клеток индукция дифференцировки происходит значительно чаще, чем в исходной родительской линии ЭСК НМ-1. Подобный эффект наблюдается и при формировании первичных колоний: многие первичные колонии эмбриональных гибридных клеток дифференцируются на ранних стадиях образования с большими потерями клонов в ходе их селекции и размножения.

Таким образом, цитогибриды, созданные при слиянии ЭСК с соматическими клетками, несмотря на тесный контакт с геномом дифференцированных клеток, сохраняют плюрипотентность как уникальное свойство эмбрионального генома. Более того, в таких гибридных клетках возможно репрограммирование индивидуальных хромосом, происходящих из диффренцированных клеток. Остается неясным, насколько полно сохраняются плю- рипотентные свойства эмбрионального генома в гибридных клетках, в частности, их способность участвовать в формировании зародышевого пути у химер. Для этого необходимо получение эмбриональных гибридных клеток с нормальным кариотипом. В любом случае плюрипотентные эмбриональные гибридные клетки могут стать реальной генетической моделью для идентификации хромосом, вовлеченных в поддержание плюрипотентности или ее контролирующих, поскольку двусторонняя сегрегация родительских хромосом потенциально предоставляет такую возможность.

Не менее привлекательным представляется исследование феномена, который О. Серов и соавторы (2001) определяют как “хромосомную память”. В гибридном геноме гомологичные хромосомы находятся в двух альтернативных конфигурациях: гомологи соматического партнера однажды подверглись дифференцировке, тогда как у гомологов плюрипотентного партнера этот процесс только начинается. Следовательно, сохранение высоких плюрипотентных свойств гибридными клетками свидетельствует о том, что “плюрипотентная” конфигурация гомологов ЭСК достаточно устойчива в гибридном геноме, несмотря на влияние трансдействующих факторов, исходящих от соматического партнера. Описанные выше признаки репрограммирования гомологичных хромосом дифференцированного генома при развитии химер не исключают того, что на первых этапах образования и культивирования цитогибридов in vitro они сохраняют свой статус, приобретенный в ходе дифференцировки in vivo. Согласно недавно полученным данным, при переносе эмбриональных гибридных клеток в неселективную среду в них наблюдается интенсивная элиминация хромосом только соматического партнера, то есть, геном гибридных клеток легко дискриминирует гомологи после культивирования in vitro в течение 10-15 пассажей. Таким образом, эмбриональные гибридные клетки представляют перспективную экспериментальную модель для изучения не только такого фундаментального свойства эмбрионального генома, как плюрипотентность, но и ее альтернативы - эмбриональной дифференцировки.

Терапевтическая эффективность трансплантации эмбриональных стволовых клеток

Перед анализом терапевтической эффективности трансплантации ЭСК и их производных резюмируем приведенный выше материал. Возможности ЭСК в плане полной реализации эмбриогенеза in vitro недостаточны, поскольку дефекты развития в этом случае обусловлены отсутствием мезенхимальных стволовых клеток, которые в организме возникают автономно и независимо от ЭСК. Генетические потенции ЭСК меньше генетического потенциала зиготы, поэтому непосредственно для клонирования зародышей ЭСК не используются. Уникальный биологический потенциал ЭСК как единственных клеток, в которых программы развития развернуты в полном объеме последовательной реализации, находит применение в исследованиях по изучению функции генов. С помощью ЭСК проводится расшифровка первых комбинаций сигналов, активирующих экспрессию ранних и поздних генов, кодирующих развитие трех зародышевых листков. Сохранение плюрипотентности генома ЭСК in vitro делает их уникальным инструментом для репаративной регенерации, способным в автоматическом режиме восполнять клеточные потери при повреждении органов и тканей. В идеальном гипотетическом варианте можно допустить, что “... при трансплантации донорских ЭСК в организм реципиента переносятся компактно упакованные программы, которые при благоприятных условиях реализуются в строительство новой ткани’7, способной “... эффективно встраиваться в организм реципиента как на морфологическом, так и функциональном уровне”.

Естественно, что вслед за разработкой приемов монодифференцировки ЭСК началось изучение in vivo функциональной активности клеток, полученных in vitro из одного специализированного клона. Пролиферирующий клон ЭСК генерирует популяции мигрирующих прогениторных клеток, действительно способных активно встраиваться в зоны повреждения тканей реципиента, что и используется в регенеративно-пластической медицине. Установлено, что трансплантация ДОФА-нейронов в substantia nigra уменьшает клинические проявления при экспериментальном гемипаркинсонизме. Региональные пересадки донорских нейральных стволовых клеток снижают степень двигательных нарушений, вызванных травмой или контузией спинного и головного мозга. Получены и первые положительные результаты трансплантации стволовых клеток при демиелинизирующих заболеваниях. Казалось бы, что регенеративно-пластические потенции ЭСК открывают неограниченные возможности для использования клеточной трансплантации в практической медицине. Однако при пересадке в эктопические зоны ЭСК неизбежно трансформируются в опухоли. При подкожном введении ЭСК у иммунодефицитных мышей образуются тератомы. При пересадке взвеси ЭСК под капсулу семенника у сингенных мышей также происходит формирование тератом, состоящих из разных тканей, клетки которых являются производными всех трех зародышевых листков. В таких тератомах крайне редко осуществляются процессы редуцированного органогенеза.

В целом ряде работ приводятся сведения о положительных результатах пересадки ранних дериватов ЭСК животным с экс-периментальной патологией. Клеточная нейротрансплантация с использованием производных ЭСК получает дальнейшее развитие в эксперименте и первых клинических испытаниях по коррекции функциональных нарушений при мозговой и спинальной травмах, лечению сирингомиелии и рассеянного склероза (Репин, 2001). С появлением техники нейроногенеза из ЭСК in vitro вместо использования ткани эмбрионального мозга разрабатываются методы трансплантации производных нейросфер, полученных из культур эмбриональной нервной ткани. Такие трансплантационные суспензии значительно более гомогенны и содержат коммитированные предшественники нейронов и нейроглии.

При регулярном добавлении в культуральную среду ретиноевой кислоты в дозе 10 мкг/мл в течение 6 недель в линии эмбрио-(терато)-карциномы человека NTERA-2 образуется более 80% постмитотических нейронов. Полная гомогенность нейрональной популяции достигается с помощью проточной сортировки меченных иммунофенотипическими маркерами зрелых нейронов, что позволяет избавиться от остатков тератокарциномных и незрелых клеток. После трансплантации в различные регионы мозга экспериментальных животных такие нейроны не только выживают, но и встраиваются в регионарные нейронные сети. У животных с экспериментальными моделями локальных дефектов ЦНС нейротрансплантация уменьшает клинические проявления такой патологии человека, как последствия черепномозговой травмы, инсульта, демиелинизирующих заболеваний, наследственных дефектов развития мозжечка, болезней отложения липидов и полисахаридов.

Для оптимизации процессов регенерации при дегенеративных заболеваниях ЦНС разрабатываются технологии получения из ЭСК миелинпродуцирующих олигодендроцитов. Первый этап традиционно включает пролиферацию ЭСК с размножением необходимого для трансплантации количества клеток. На втором этапе осуществляется направленная дифференцировка клеток в популяцию миелинпродуцирующих предшественников олигодендроцитов, что контролируется селективными маркерными антигенами.

Определенные перспективы открываются для использования производных ЭСК с целью разработки методов коррекции иммунодефицитов, вызванных генетическими дефектами созревания тимуса. В исследованиях на нокаутных (rag 1) мышах с индуцированным генным дефектом - нарушением механизма рекомбинации V(D)J локусов TCR генов, приводящим к потере функции Т-лимфоцитов, трансплантация ранних производных ЭСК в тимус животных восстанавливает созревание нормальных популяций иммунных клонов, ответственных за клеточный иммунитет. Проводятся клинические испытания трансплантации преформированных in vitro ЭСК для лечения фатальных наследственных анемий у детей.

Возражения против быстрого внедрения трансплантации стволовых клеток в клинику обосновываются ограниченным числом стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека и необходимостью их стандартизации. Для повышения чистоты стандартизированных линий ЭСК, а также стволовых клеток взрослого человека предлагается использовать метод отбора линий на основании молекулярно-генетического анализа коротких тандемных повторов ДНК. Необходимой является также и проверка линий ЭСК на наличие мелких хромосомных перестроек и генетических мутаций, потенциальная возможность возникновения которых в условиях культивирования клеток достаточно велика. Выдвигается тезис об обязательном тестировании свойств всех типов ЭСК и регионарных полипотентных стволовых клеток, так как их размножение in vitro может привести к возникновению новых характеристик, не присущих стволовым клеткам эмбриона или дефинитивных тканей. В частности, допускается, что длительное культивирование в средах с цитокинами приближает линии ЭСК к опухолевым клеткам, поскольку в них происходят схожие изменения путей регуляции клеточных циклов с приобретением способности к осуществлению неограниченного числа клеточных делений. Некоторые авторы на основании потенциальной возможности развития опухолей считают трансплантацию человеку ранних производных стволовых эмбриональных клеток безрассудством. По их мнению, гораздо безопаснее использовать коммитированных потомков ЭСК, то есть, линии родоначальников дифференцированных клеток. Однако в настоящее время еще не разработана надежная техника получения стабильных линий клеток человека, дифференцирующихся в нужном направлении.

Таким образом, в литературе появляется все больше данных о позитивном терапевтическом эффекте трансплантации производных эмбриональных стволовых клеток человека. Однако многие из таких работ подвергаются пересмотру и критике. Некоторые исследователи полагают, что результаты ранних клинических испытаний имеют характер предварительных и свидетельствуют лишь о том, что стволовые клетки способны оказывать благоприятное воздействие на клиническое течение того или иного заболевания. Поэтому необходимо получить данные об отдаленных результатах клеточной трансплантации. В качестве аргумента приводятся этапы развития клинической нейротрансплантологии. Действительно, в литературе поначалу преобладали публикации о высокой эффективности пересадки фрагментов мозга эмбрионов при болезни Паркинсона, но затем начали появляться сообщения, отрицающие лечебную эффективность эмбриональной или фетальной нервной ткани, пересаженной в мозг больных.

Проведены первые клинические испытания с оценкой безопасности трансплантации нейробластов - производных ЭСК тератокарциномы NTERA-2, незрелые клетки которой подвергались пролиферации в культуре до накопления 100-миллионной клеточной массы. Часть полученных таким образом клеток использовалась для характеристики фенотипа и определения клеточных примесей, а также для тестирования возможной контаминации вирусами и бактериями. Из культуральной среды удаляли LIF и фидерный слой стромальных фетальных клеток и создавали условия для направленной дифференцировки ЭСК в нейробласты с помощью комбинации цитокинов и факторов роста. Затем нейробласты очищали от незрелых клеток тератокарциномы на проточном клеточном сортере. После вторичной очистки и характеристики фенотипа трансплантируемых клеток суспензию нейробластов (10-12 млн) с помощью специальной микроканюли и шприца под контролем стереотаксиса и компьютерной томографии вводили в базальное ядро мозга пациентов (на седьмой месяц после геморрагического инсульта). Посттрансплантационный одногодовой скрининг последствий трансплантации нейронов в зону инсульта не выявил побочных и нежелательных эффектов. У половины пациентов происходило улучшение двигательной функции в период от 6 до 12 месяцев после пересадки. Положительные клинические сдвиги сопровождались повышением кровоснабжения зоны инсульта после трансплантации клеток: средний прирост поглощения флуоресцентно-меченой 2-дезоксиглюкозы, по данным позитронной эмиссионной томографии, достигал 18%, а у отдельных пациентов - 35%.

Однако Национальный институт здоровья США провел независимое исследование клинической эффективности нейротрансплантации у больных паркинсонизмом. Пациентам первой группы пересаживали участки эмбриональной нервной ткани, вырабатывающие дофамин, тогда как второй группе больных делали ложную операцию. Результаты свидетельствуют о нулевой клинической эффективности такой нейротрансплантации, несмотря на то что дофаминпродуцирующие эмбриональные нейроны выживали в мозге реципиентов. Более того, через 2 года после пересадки эмбриональной нервной ткани у 15% пациентов развилась персистентная дискинезия, отсутствующая у больных группы плацебо (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Наблюдения за дальнейшим развитием заболевания у этих пациентов продолжаются.

Некоторые авторы связывают противоречивость литературных данных по оценке клинической эффективности нейротрансплантации с разным подходом к подбору групп больных, неадекватным выбором методов объективной оценки их состояния, а, главное, разными сроками развития эмбриональной нервной ткани и разными участками мозга, из которых эту ткань получали, разными размерами трансплантата и методическими особенностями операционного вмешательства.

Надо заметить, что попытки непосредственной трансплантации плюрипотентных стволовых эмбриональных клеток в область полосатого тела мозга крыс с экспериментальным гемипаркинсонизмом сопровождались пролиферацией ЭСК и их дифференцировкой в дофаминергические нейроны. Следует полагать, что новообразованные нейроны эффективно встраивались в нейрональные сети, поскольку после трансплантации ЭСК наблюдалась коррекция аномалий поведения и двигательной асимметрии в апоморфиновом тесте. В то же время часть животных погибла вследствие трансформации пересаженных ЭСК в опухоли головного мозга.

Эксперты Национальной и Медицинской академий США, специалисты Национального института здоровья США считают, что клинический потенциал ЭСК заслуживает самого серьезного внимания, однако настаивают на необходимости детального изучения их свойств, вероятности осложнений и отдаленных последствий в опытах на адекватных биологических моделях заболеваний человека (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

С этой точки зрения важно, что сравнительный гистологический анализ экспериментальных тератом, полученных при трансплантации в семенник взвеси ЭСК, с тератомами, сформировавшимися вследствие пересадки раннего зародыша, в составе которого также присутствуют ЭСК, показал, что ЭСК вне зависимости от источника их происхождения или взаимодействия с теми или иными окружающими клетками одинаковым образом реализуют свои туморогенные потенции. Доказано, что такие тератомы имеют клональное происхождение, так как из одной ЭСК могут возникать опухоли, состоящие из производных всех трех зародышевых листков (.Рега, 2001). Примечательно, что при трансплантации иммунодефицитным мышам клонированных ЭСК с нормальным кариотипом также формировались тератомы, состоящие из различных типов дифференцированных соматических клеток. Эти экспериментальные данные - безупречное доказательство клонального происхождения тератом. С точки зрения биологии развития, они свидетельствуют о том, что не множественные коммитированные клетки-предшественники, а единичная плюрипотентная стволовая клетка выступает источником дифференцированных производных всех трех зародышевых листков, составляющих тератому. Однако на пути практической клеточной трансплантации результаты этих исследований являются если не запрещающим, то предупреждающим знаком потенциальной опасности, поскольку инокуляция ЭСК или первичных половых клеток в разные ткани взрослых иммунодефицитных мышей неизбежно вызывает развитие опухолей из пересаженных стволовых клеток. Неопластическое перерождение эктопически пересаженных ЭСК сопровождается возникновением сателлитных популяций дифференцированных клеток - за счет частичной дифферен- цировки ЭСК и прогениторных клонов в специализированные линии. Интересно, что при пересадке ЭСК в скелетные мышцы рядом с тератокарциномными клетками чаще всего образуются нейроны. Однако введение ЭСК в дробящуюся яйцеклетку или бластоцисту сопровождается полной интеграцией клеток в зародыш без формирования неопластических элементов. При этом ЭСК встраиваются практически во все органы и ткани эмбриона, включая половой зачаток. Такие аллофенные животные впервые были получены при введении клеток тератокарциномы 129 в ранние зародыши на стадиях 8-100 клеток. У аллофенных мышей популяции гетерогеномных клеток-производных ЭСК донора внедряются в ткани костного мозга, кишечника, кожи, печени и половых органов, что позволяет создавать в эксперименте даже межвидовые клеточные химеры. Чем меньше сроки развития раннего зародыша, тем выше процент клеточной химеризации, причем самая высокая степень химеризации наблюдается в кроветворной системе, коже, нервной системе, печени и тонкой кишке аллофенного зародыша. Во взрослом организме химеризации поддаются ткани, защищенные от воздействия иммунной системы реципиента гистогематическими барьерами: пересадка первичных половых клеток в паренхиму яичка сопровождается встраиванием донорских стволовых клеток в герменативный слой ткани реципиента. Тем не менее, при трансплантации ЭСК в бластоцисту образования химерных зачатков половых органов с генерацией донорских первичных половых клеток не происходит. Плюрипотентность ЭСК при создании специальных условий может быть использована и для клонирования: трансплантация ЭСК мышей в 8-16-клеточный мышиный зародыш, клеточные митозы в котором блокированы цитокалазином, способствует реализации нормального эмбриогенеза с развитием зародыша из донорских ЭСК.

Следовательно, альтернативой трансплантации аллогенных ЭСК является терапевтическое клонирование, основанное на пересадке ядер соматических клеток в энуклеированную яйцеклетку для создания бластоцисты, из внутренней клеточной массы которой затем выделяются линии генетически идентичных донору соматического ядра ЭСК. Технически эта идея вполне осуществима, поскольку возможность создания линий ЭСК из бластоцист, полученных после трансплантации соматических ядер в энуклеированные яйцеклетки, неоднократно доказана в экспериментах на лабораторных животных (Nagy, 1990; Munsie, 2000). В частности у мышей, гомозиготных по мутации гена rag2, фибробласты, полученные при культивировании клеток субэпидермальной ткани, использовались в качестве доноров ядер, которые трансплантировали в энуклеированные ооциты. После активации ооцитов “зиготу” культивировали до образования бластоцисты, из внутренней клеточной массы которой изолировали ЭСК и переводили их в линию нуллизиготных по мутантному гену клеток (rag2~/~). Методом гомологичной рекомбинации в таких ЭСК корригировали мутацию одного аллельного гена. В первой серии экспериментов из ЭСК с рекомбинантным восстановленным геном получали эмбриоидные тельца, трансфицировали их клетки рекомбинантным ретровирусом (HoxB4i/GFP) и после размножения вводили в вену мышей rag2~/~. Во второй серии тетраплоидные бластомеры агрегировали с генетически модифицированными ЭСК и трансплантировали их самкам-реципиентам. Родившиеся иммунокомпетентные мыши служили донорами костного мозга для трансплантации мутантным мышам rag2~/~. В обеих сериях результат был положительным: через 3-4 недели у всех мышей были обнаружены зрелые нормальные миелоидные и лимфоидные клетки, способные продуцировать иммуноглобулины. Таким образом, пересадку в ооцит ядер соматических клеток можно использовать не только для получения линий ЭСК, но и для цитогенотерапии - коррекции наследственных аномалий, применяя ЭСК в качестве вектора для транспорта корригирующей генетической информации. Но и в этом направлении клеточной трансплантации, кроме биоэтических проблем, имеются свои ограничения. Не ясно, насколько безопасной окажется трансплантация терапевтически клонированных клеток с генотипом, идентичным генотипу конкретного больного, поскольку такие клетки могут привносить мутации, создающие предрасположенность к иным заболеваниям. Нормальные яйцеклетки человека остаются труднодоступным объектом, тогда как даже при пересадке соматических ядер в энуклеированные яйцеклетки животных только 15-25% сконструированных “зигот” развивается до стадии бластоцисты. При этом не определено, какое количество бластоцист потребуется для получения одной линии плюрипотентных клонированных ЭСК. Следует отметить и высокий уровень финансовых затрат, связанных со сложностью методологии терапевтического клонирования.

В заключение отметим, что в ЭСК плюрипотентность генома с гипометилированной ДНК сочетается с высокой активностью теломеразы и короткой С^фазой клеточного цикла, что обеспечивает их интенсивное и потенциально бесконечное размножение, в процессе которого ЭСК сохраняют диплоидный набор хромосом и “ювенильный” набор фенотипических характеристик. Клональный рост ЭСК в культуре не препятствует их дифференцировке в любую специализированную клеточную линию организма при остановке пролиферации и добавлении соответствующих регуляторных сигналов. Рестрикционная дифференцировка ЭСК в линии соматических клеток in vitro реализуется без участия мезенхимы, в обход Нохтеяов, вне органогенеза и без формирования зародыша. Эктопическое введение ЭСК in vivo неизбежно приводит к образованию тератокарцином. Трансплантация ЭСК в бластоцисту или ранний зародыш сопровождается их интеграцией с тканями эмбриона и стабильной химеризацией его органов.

Регенеративно-пластические технологии, основанные на клеточной трансплантации, являются точкой пересечения интересов представителей клеточной биологии, биологии развития, экспериментальной генетики, иммунологии, неврологии, кардиологии, гематологии и многих других отраслей экспериментальной и практической медицины. Наиболее важны результаты экспериментальных исследований, доказывающие возможность перепрограммирования стволовых клеток с направленным изменением их свойств, что открывает перспективы для управления процессами цитодифференцировки с помощью факторов роста - для регенерации миокарда, восстановления поражений ЦНС и нормализации функции островкового аппарата поджелудочной железы. Однако для широкого внедрения трансплантации производных ЭСК в практическую медицину необходимо более детально исследовать свойства стволовых клеток человека и продолжить опыты с ЭСК на экспериментальных моделях заболеваний.

Биоэтические вопросы и проблему отторжения аллогенного клеточного трансплантата могла бы решить обнаруженная пластичность генома регионарных стволовых клеток взрослого организма. Однако первоначальные сведения о том, что при пересадке в печень изолированных и тщательно охарактеризованных гемопоэтических аутогенных клеток, из которых происходят новые гепатоциты, встраивающиеся в печеночные дольки, сейчас подвергаются пересмотру и критике. Тем не менее, опубликованы данные о том, что трансплантация нейральных стволовых клеток в тимус вызывает образование новых донорских ростков Т- и В-лимфоцитов, а пересадка стволовых нервных клеток головного мозга в костный мозг приводит к формированию гемопоэтических ростков с длительным донорским миело- и эритропоэзом. Следовательно, в органах взрослого организма могут сохраняться плюрипотентные стволовые клетки, способные к перепрограммированию генома до потенциала ЭСК.

Источником получения ЭСК для применения в медицинских целях остается эмбрион человека, что предопределяет неизбежность нового пересечения моральных, этических, нравственных, юридических и религиозных проблем в точке зарождения человеческой жизни. Открытие ЭСК дало мощный толчок к возобновлению жестких дискуссий о том, где проходит грань между живыми клетками и веществом, существом и личностью. В то же время универсальных норм, правил и законов относительно применения ЭСК в медицине, несмотря на неоднократные попытки их создания и принятия, не существует. Каждое государство в рамках своего законодательства решает эту проблему самостоятельно. Со своей стороны, медики всего мира продолжают попытки вывести регенеративно-пластическую медицину за рамки таких дискуссий, прежде всего за счет использования не эмбриональных стволовых клеток, а стволовых клеточных резервов взрослого организма.

Немного из истории выделения эмбриональных стволовых клеток

Терато-(эмбрио)-карциномные клетки выделялись из спонтанно возникающих тестикулярных тератом мышей линии 129/ter-Sv, спонтанных овариальных тератом мышей линий Lt/Sv, а также из тератом, источником которых были эктопично трансплантированные клетки или ткани эмбрионов. Среди полученных таким образом стабильных мышиных линий терато-(эмбрио)-карциномных клеток некоторые являлись плюрипотентными, другие подвергались дифференцировке только в клетки одного определенного типа, а некоторые вообще были неспособны к цитодифференцировке.

В свое время в центре внимания находились исследования, результаты которых свидетельствовали о возможности возврата терато-(эмбрио)-карциномных клеток к нормальному фенотипу после их введения в ткани развивающегося эмбриона, а также работы по созданию in vitro генетически модифицированных терато-(эмбрио)-карциномных клеток, с помощью которых получали мышей-мутантов для биологического моделирования наследственной патологии человека.

Для выделения линий терато-(эмбрио)-карциномных клеток использовалось кондиционированное суспензионное культивирование. В культуре терато-(эмбрио)-карциномные клетки, как и ЭСК, растут с образованием эмбриоидных телец и требуют для перевода в линию обязательной диссоциации, сохраняя плюрипотентность на фидерном слое из эмбриональных фибробластов или при суспензионном культивировании в кондиционированной среде. Клетки плюрипотентных терато-(эмбрио)- карциномных линий крупные, шарообразные, характеризуются высокой активностью щелочной фосфатазы, формируют агрегаты и способны к разнонаправленной дифференцировке. При введении в бластоцисту они агрегируют с морулой, что приводит к образованию химерных зародышей, в составе различных органов и тканей которых обнаруживаются производные терато-(эмбрио)-карциномных клеток. Однако подавляющая часть таких химерных зародышей погибает внутриутробно, а в органах выживших новорожденных химер чужеродные клетки выявляются редко и с невысокой плотностью. В то же время частота возникновения опухолей (фибросаркома, рабдомиосаркома, другие виды злокачественных опухлей и аденома поджелудочной железы) резко возрастает, причем опухолевое перерождение зачастую происходит еще в период внутриутробного развития химерных зародышей.

Большая часть терато-(эмбрио)-карциномных клеток в микро-окружении нормальных эмбриональных клеток почти закономерно приобретает злокачественные неопластические характеристики. Считается, что необратимая малигнизация обусловлена активацией протоонкогенов в процессе структурных перестроек. Одним из исключений являются клетки эмбриокарциномной линии SST3, полученной из тератом мышиных семенников (линия 129/Sv-ter), которые проявляют высокую способность интегрироваться в ткани и органы зародыша без последующего образования опухолей у химерных мышей. Производные терато-(эмбрио)-карциномных клеточных линий у мышей-химер практически не принимают участия в образовании первичных гоноцитов. Очевидно, это связано с высокой частотой хромосомных аберраций, характерных для большинства терато-(эмбрио)-карциномных линий, в клетках которых наблюдается как анэуплоидия, так и хромосомные аномалии.

В лабораторных условиях было получено несколько стабильных линий терато-(эмбрио)-карциномных клеток человека, характеризующихся плюрипотентностью, высокой пролиферативной активностью и способностью к дифференцировке при росте в культурах. В частности, линия терато-(эмбрио)-карци- номных клеток человека NTERA-2 использовалась для изучения механизмов нейральной цитодифференцировки. После трансплантации клеток данной линии в субвентрикулярную область переднего мозга новорожденных крыс наблюдалась их миграция и нейроногенез. Предпринимались даже попытки пересадки нейронов, полученных при культивировании клеток терато-(эмбрио)-карциномной линии NTERA-2, больным с инсультами, что, по мнению авторов, приводило к улучшению клинического течения заболевания. При этом случаев малигнизации трансплантированных клеток терато-(эмбрио)-карциномной линии NTERA-2 у пациентов с инсультом не отмечалось.

Первые линии недифференцированных плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мышей в начале 80-х годов прошлого века получили Эванс и Мартин, выделив их из внутренней клеточной массы бластоцисты - эмбриобласта. Выделенные линии ЭСК в течение длительного времени сохраняли плюрипотентность и способность дифференцироваться в различные типы клеток под воздействием факторов специальной среды культивирования.

Сам термин “эмбриональная плюрипотентная стволовая клетка” принадлежит Лерою Стивенсу, который при исследовании воздействия табачной смолы на частоту развития опухолей обратил внимание на спонтанное возникновение тестикулярной тератокарциномы у линейных (129/v) мышей контрольной группы. Клетки тератокарцином семенников отличались высокой скоростью пролиферации, а в присутствии жидкости из брюшной полости выходили в спонтанную дифференцировку с формированием нейронов, кератиноцитов, хондроцитов, кардиомиоцитов, а также волос и фрагментов костной ткани, но без каких-либо признаков упорядоченной цитоархитектоники соответствующей ткани. При высадке в культуру клетки тератокарцином росли неприкрепленными к подложке плюрипотентными клонами и формировали эмбриоидные тельца, после чего прекращали деление и подвергались спонтанной беспорядочной дифференцировке в нейроны, глию, мышечные клетки и кардиомиоциты. Стивенс установил, что тератокарцинома мышей 129/v содержит менее 1% клеток, способных дифференцироваться в разнообразные специализированные соматические линии, а сама дифференциация зависит от факторов, которые на них воздействуют (состав жидкости брюшной полости, продукты добавленных в культуру зрелых клеток или тканей). Предположение Лероя Стивенсона о наличии среди клеток тератокарциномы эмбриональных прогениторных клеток полового зачатка подтвердилось: суспензия клеток эмбриобласта доимплантационных зародышей в тканях взрослых мышей формировала тератокарциномы, а выделенные из них чистые клеточные линии после интраперитонеального введения животным-реципиентам дифференцировались в нейроны, кардиомиоциты и другие соматические клетки-производные всех трех зародышевых листков. В экспериментах in vivo трансплантация ЭСК (полученных из эмбриобласта, но не трофобласта) в зародыши мыши иной линии на стадиях 8-32 бластомер заканчивалась рождением химерных животных (без возникновения опухолей), в органах которых обнаруживались ростки донорской ткани. Химеризм наблюдался даже в линии половых клеток.

Первичные прогениторные половые клетки, выделенные из полового зачатка мышиного эмбриона, по морфологии, иммунологическому фенотипу и функциональным характеристикам соответствовали ЭСК, полученным Стивенсоном из тератокарциномы и эмбриобласта. У химер, рожденных после введения ЭСК в бластоцисту, аллофенный морфогенез органов характеризовался мозаичным чередованием донорских и реципиентных структурно-функциональных единиц печени, легких и почек. В ряде случаев наблюдалось образование крипт кишечника или дольки печени, состоящих одновременно из клеток реципиента и донора. Однако всегда реализация морфогенеза происходила по генетической программе вида, к которому принадлежал реципиент, а химеризм ограничивался исключительно клеточным уровнем.

Затем было установлено, что пролиферация ЭСК без цитодифференцировки на фидерном слое клеток-производных мезенхимы (фетальные фибробласты) происходит при обязательном присутствии LIF в селективных питательных средах, которые избирательно обеспечивают выживание только стволовых и прогениторных клеток, тогда как подавляющее большинство специализированных клеточных элементов погибает. С помощью таких методик в 1998 году Джеймсом Томсоном были выделены пять иммортализованных линий эмбриональных стволовых клеток из внутренней клеточной массы бластоцисты человека. В том же году Джон Герхарт разработал метод выделения бессмертных линий ЭСК из полового бугорка четырех-пятинедельных эмбрионов человека. Благодаря своим уникальным свойствам, всего через два года эмбриональные стволовые клетки и стволовые клетки дефинитивных тканей уже начали использоваться в практике регенеративной медицины и генной терапии.

!
Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.

Медицинский эксперт-редактор

Портнов Алексей Александрович

Образование: Киевский Национальный Медицинский Университет им. А.А. Богомольца, специальность - "Лечебное дело"

Другие врачи





Новейшие исследования по теме Эмбриональные стволовые клетки

Рак – самая распространенная в мире причина смерти, от него ежегодно умирают более семи миллионов человек. Раковая опухоль может поразить любую часть тела, а шансы на выживание могут быть различными в зависимости от вида рака и того, где живет...

Лечение стволовыми клетками помогает установить контроль над мочеиспусканием и устранить посттравматические боли после повреждения спинного мозга у подопытных грызунов.

Поделись в социальных сетях

Сообщите нам об ошибке в этом тексте:
Просто нажмите кнопку "Отправить отчет" для отправки нам уведомления. Так же Вы можете добавить комментарий.