^

Здоровье

A
A
A

Диагностика герпеса

 

Диагностика герпеса основана на проведении классического вирусовыделения на чувствительных клеточных культурах, иммунофлюоресцентным и серологическим методами, проведении кольпоскопического исследования, использования современных молекулярно-биологических методов (ПЦР, дот-гибридизация), что позволяет диагностировать всю группу герпесвирусов, включая ВГЧ-6 и ВГЧ-7 типов.

Методы лабораторной диагностики герпетической инфекции

Основные методы, направленные на выделение ВПГ или обнаружение вирусных частиц и/или их компонентов

Вспомогательные методы, направленные на выявление антител к ВПГ в биологических жидкостях организма человека

  1. Выделение ВПГ на чувствительных культурах клеток и животных
  2. Прямая и иммунная электронная микроскопия
  3. Прямой и непрямой варианты МФА
  4. ИФА
  5. Молекулярно-биологические методы
  6. Реакция агглютинации латекса
  1. Реакция нейтрализации
  2. РСК
  3. Определение антител к неструктурным белкам ВПГ-1,2

Показано, что у 76% больных генитальный герпес (ГГ) вызван ВПГ-2, а у 24% - ВПГ-1 типа. Причем ГГ как моноинфекция протекал лишь у 22% больных, в 78% случаев были выявлены микробные ассоциации. У 46% лиц выявлен паразитоценоз, обусловленный двумя возбудителями, в том числе хламидии были выявлены в 40% случаев. Реже в мазках определяли гарднереллы, трихомонады, гонококки.

У 27% больных паразитоценоз был представлен тремя, у 5,2% - четырьмя возбудителями. Причём чаще отмечалось сочетание хламидии с гарднереллами и грибами рода Candida. Эти данные обосновывают необходимость тщательного бактериологического обследования больных ГГ с целью выявления сочетаний патогенных агентов, а также углубленного изучения патогенеза смешанных инфекций урогенитального тракта, что позволит проводить дифференцированную комплексную терапию герпетической инфекции.

Материалы, исследуемые при выделении ВПГ в зависимости от локализации герпетических поражений

Локализация
поражений

Содержимое
везикул

Соскоб клеток

СМЖ

Аспират из бронхов

Биоптат

Кровь

1

2

3

4

Кожа

+

 

 

 

 

 

 

 

+

Глаза

 

 

+

 

 

 

 

 

+

Гениталии

 

 

 

+

 

 

 

 

+

Анус

+

 

 

 

+

 

 

 

+

Рот

+

+

 

 

 

 

 

 

+

ЦНС

+

 

 

 

 

+

 

+

+

Легкие

 

+

 

 

 

 

+

 

+

Печень

 

 

 

 

 

 

 

+

+

Врожденный
герпес

+

+

+

 

 

 

+

 

+

Методы лабораторной диагностики цитомегаловирусной инфекции

Методы

Время, необходимое для получения результатов

Примечания

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ

Электронная микроскопия

3 часа

Малодоступен

Выделение вируса в культуре клеток (ЦПД)

4-20 дней

Стандартный,
Медленный

Иммунофлюоресцентное окрашивание ранних АГ с применением моноклональных антител

6 часов

Менее
специфичный

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ

2-3 часа

Менее
специфичный

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ

РСК

2 дня

Стандартный

РГА

1 день

Трудоемкий

РИФ

6 часов

Простой,
специфичный

НРИФ

6 часов

Сложный

РИМФ

6 часов

Сложный

ИФА (IgМ, ДО)

6 часов

Быстрый, простой

Иммуноблот

6 часов

Дорогостоящий

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ

МГ

5-7 дней

Дорогостоящий,
трудоемкий

ПЦР

3 часа

Дорогостоящий

Методы диагностики вируса опоясывающего герпеса

Методы
диагностики

Лабораторные
методики

НЕПРЯМОЙ

Выделение

Культура ткани, куриные эмбрионы, лабораторные животные, совместное культивирование с пермиссивными клетками или вирусами-помощниками

Идентификация изолятов

Реакция нейтрализации, РСК, ИФ, ПИЭФ, реакция изолятов преципитации, агглютинации, ИФ

ПРЯМОЙ

Цитология

Мазки: цветовая иммунофлюоресценция

Гистология

Патоморфология клетки

Структура

Эмбриональная микроскопия, иммуноэлектронная микроскопия

Определение антигенов

ИФ, ПИЭФ, РИМ, ИФА

Определение местной выработки антител

Ig М, Ig G, Ig А: ИФА, РИА

Молекулярно­биологические подходы

Молекулярная гибридизация, ПЦР

Лабораторная диагностика инфекции, вызываемой вирусом опоясывающего герпеса

Диагностические
проблемы

Методы

Ожидаемые результаты

Острая первичная инфекция

1

Обнаружение через 2 часа

2

Уровень антител растет медленно

3

Присутствуют через 3 дня после инфекции

Острая
реактивированная
инфекция

1

Обнаружение УЪУ через 2 часа

2

Уровень антител растет медленно

4

Присутствуют через 4 дня после появлений высыпаний

  1. определение в жидкости везикул ВИЭФ;
  2. cерология: РСК, ИФА, направленные на выявление
  3. cерология: ИФА, направленные на выявление IgМ;
  4. серология: ИФА, направленные на выявление IgА, IgM.

Методы индикации иммунного ответа инфекции, обусловленной вирусом опоясывающего герпеса

Подход

Метод

Обнаружение повышения титра антител во вторых сыворотках

РСК, РТГА, РПГА, реакция нейтрализации ИФ, РИМ, ИФА

Обнаружение Ig G, Ig A класспецифических антител в первой пробе сыворотки

ИФА, ИФ, РИМ, латекс-аглютинация

Интерпретация результатов серологического обследования сывороток больных на герпесвирусные инфекции (ИФА)

Название
инфекции/маркера

Средние пороговые значения для инфекций

Результаты анализа

Интерпретация

Цитомегалия Анти-CMV IgG (1-20 Е/мл)

Анти-CMV IgM (100-300%)

Положительный 1-6 Положительный 6-10 Положительный >10
Отрицательный
Положительный 100-300 Отрицательный <90 Сомнительный 90-100

Ремиссия
Обострение болезни
Острая фаза болезни
Нет инфицирования (заболевания)
Острая фаза болезни
Повторить анализ через 2-3 недели

Герпес простой 1,2 серотипов
Анти-HSV 1/2 общ. (100-900%)

Положительный 100-400 Положительный 400-800 Положительный >800
Отрицательный <100

Ремиссия
Обострение болезни
Острая фаза болезни
Нет инфицирования (заболевания)

В таблице представлены основные методы лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций, а также рекомендованы биологические материалы, которые исследуются при выделении ВПГ с учетом локализации герпетических поражений

Достоверным является выделение вырусов простого герпеса и ЦМВ с помощью заражения чувствительных клеточных культур. Так, при вирусологическом обследовании 26 больных в период рецидива ВПГ был выделен на чувствительной культуре клеток Vero в 23 случаях (88,4%). В зараженных культурах наблюдалась характерная для ВПГ картина цитопатического действия - образование многоядерных гигантских клеток или скопление округлых и увеличенных в размере клеток в виде гроздьев. В 52,1% случаев уже к 16-24 ч. после заражения можно было обнаружить очаги цитопатического действия вируса. К 48-72 часам инкубации зараженных культур процент материалов, вызывающих специфическую деструкцию клеток, увеличился до 87%. И лишь в 13% случаев положительные результаты были выявлены через 96 часов после заражения и более или при повторном пассировании.

Методы лабораторной диагностики генерализованной герпетической инфекции

Основные методы, направленные на обнаружение (выделение) герпесвирусов, их частиц и их компонентов

Вспомогательные методы, направленные на выявление антител к вирусам герпеса в биологических жидкостях, обнаружение ферментативных сдвигов в сыворотке крови

Выделение вирусов герпеса на чувствительных культурах клеток и животных
Прямая и иммунная электронная микроскопия
Прямой и непрямой варианты иммунопероксидазного метода Прямой и непрямой варианты метода флюоресцирующих антител
Варианты твердофазного иммуноферментного анализа
Варианты метода молекулярной (ДНК- ДНК) гибридизации
Полимеразная цепная реакция
Реакция агглютинации латекса

Реакция нейтрализации
Реакция связывания комплемента
Реакция агглютинации латекса
Непрямой вариант метода флюоресцирующих антител
Непрямой вариант иммунопероксидазного метода
Варианты твердофазного иммуноферментного анализа
Метод иммунного блоттинга
Метод радиальной фиксации комплемента
Определение уровней аланин- и аспартатаминотрансфераз

Для диагностики инфекционного мононуклеоза (инфекция, вызванная ВЭБ) используют серологические методы. Реакция Пауль-Буннеля с эритроцитами барана, диагностический титр 1:28 и выше при однократном исследовании сыворотки крови, либо 4-кратный прирост антител при обследовании парных сывороток. Используют реакцию Гоффа-Бауэра со взвесью 4% формалинйзированных эритроцитов лошади. Результат учитывают через 2 минуты, при инфекционном мононуклеозе реакция высокоспецифична.

В настоящее время разрабатывается иммуноферментный (ИФА) метод диагностики инфекционного мононуклеоза. При этом антитела классов IgG и IgМ в сыворотке больного определяют путем ее инкубации с лимфобластами, зараженными ВЭБ с последующей обработкой флюоресцирующими антителами. В остром периоде заболевания антитела к вирусному капсидному антигену определяются в титре 1:160 и выше.

При использовании ряда импортных коммерческих тест-систем в ИФА можно выявить: антитела к ант игенам оболочки ВЭБ, антитела к раннему антигену ВЭБ, общие антитела к раннему антигену ВЭБ, определяющиеся в острой фазе заболевания и в ядре и в цитоплазме клетки, и ограниченные антитела к раннему ВЭБ, определяющиеся в острой фазе заболевания и в ядре и в цитоплазме клетки, ограниченные антитела к раннему антигену ВЭБ, определяющиеся в разгар заболевания только в цитоплазме клетки, и антитела к ядерному антигену ВЭБ. Использование данных тест-систем позволяет проводить дифференциальную диагностику ряда заболеваний, связанных с ВЭБ.

После положительной ИФА, выявившей антитела к ВЭБ, ставят подтверждающую реакцию иммуноблотинга, в которой определяют наличие антител к отдельным маркерным белкам ВЭБ (р-протеины): р23, р54, р72 (наличие этого белка указывает на возможность размножения ВЭБ), р 138. Указанные выше лабораторные методы используют и для контроля эффективности лечения.

Чувствительность вирусологических методов 85-100%, специфичность 100%, время исследования 2-5 дней. Часто в практической работе используется метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с поликлональными или моноклональными антителами против ВПГ-1 и ВПГ-2. Метод ПИФ достаточно легко воспроизводим в обычной клинической лаборатории, не является дорогостоящим, чувствительность выше 80%, специфичность 90-95%. При иммунофлюоресцентной микроскопии выявляли наличие цитоплазматических включений, морфологические особенности, процент инфицированных клеток в мазках-соскобах из уретры, цервикального канала, шейки матки, прямой кишки.

Метод ПИФ дает представление о морфологических свойствах клеток и изменении локализации антигенов ВПГ. Кроме прямых признаков поражения клеток вирусами герпеса (обнаружение специфического свечения) имеются косвенные признаки герпетической инфекции по данным ПИФ:

  • агрегация ядерного вещества, отслаивание кариолеммы;
  • наличие т. н. ядер-«дырок», когда от ядра клетки остается только одна кариолемма;
  • наличие внутриядерных включений - тельца Каудри.

При постановке ПИФ врач получает не только качественную, но и количественную оценку состояния инфицированных клеток, что нами было использовано для оценки эффективности проводимой противовирусной терапии ацикловиром (АЦ). Так, 80 больных простым генитальным герпесом (ГГ) обследованы методом ПИФ в динамике. Показано, что если до лечения ацикловиром в мазках 88% больных был высокий процент инфицированных клеток (50-75% и выше), то после одного курса ацикловиром в мазках 44% больных выявлялись здоровые клетки, в 31% случаев отмечены единичные инфицированные клетки и у 25% больных было до 10% инфицированных клеток.

Содержание инфицированных клеток в мазках (реакция ПИФ) больных генитальным герпесом, леченных ацикловиром

Периоды болезни

Процентное содержание в мазках

инфицированных клеток

нормальных
клеток

Более
75%

50-75%

40-50%

10%

Единичные клетки в п/зр

Рецидив (до лечения)

25%

63%

12%

 

 

 

(20)

(50)

(10)

 

 

 

Ремиссия (после лечения)

 

 

 

25%

31%

44%

 

 

 

(20)

(25)

(35)

Используя многие годы ПИФ и метод дот-гибридизации, отмечено почти в 100% случаев совпадение результатов исследования. Следует отметить, что для повышения надежности диагностики ГГ, особенно в случаях наличия субклинических и маломанифестных форм герпеса, рекомендуется использовать в работе 2-3 метода лабораторной диагностики, особенно при обследовании беременных, женщин с неблагополучным акушерским анамнезом, лиц с неуточненным гинекологическим диагнозом.

Так, при ПЦР-диагностике вирусно-бактериальных инфекций урогенитального тракта необходимо проводить оценку полученных положительных результатов с учетом анамнеза, наличия (или отсутствия) конкретных клинических симптомов болезни. Если с помощью ПЦР выявлены хламидии, то в данном случае с большой вероятностью можно говорить об инфицировании и решать соответствующим образом вопросы терапии. В случае обнаружения микоплазм (уреаплазм), являющихся условно-патогенными микроорганизмами, для подтверждения диагноза требуется провести дополнительно культуральные исследования, т. е. посев материала от больного на чувствительные клеточные культуры. Только при получении положительных результатов при культуральном анализе можно говорить о лабораторном подтверждении диагноза микоплазмоза. Этот же метод позволит при необходимости определить и чувствительность выделенных микоплазм к часто используемым лекарственным формам (антибиотикам, фторхинолонам и пр.).

Возможно одномоментное инфицирование несколькими вирусами семейства Неrреsviridae. Нередко мы выявляли инфицирование одного пациента вирусами ВПГ-1, ВПГ-2 и ЦМВ. Значительно чаще инфицированы несколькими вирусами герпеса были пациенты с клинико-лабораторными проявлениями вторичных ИДС (больные онкогематологические, онкологические, ВИЧ-инфицированные). Так, показано, что прогрессирующие при ВИЧ-инфекции клинико-иммунологические нарушения сопровождаются увеличением числа выявляемых методом молекулярной гибридизации герпесвирусов. При этом прогностически наиболее значимым можно считать комплексное одномоментное выявление ДНК ВПГ-1, ЦМВ и ВГЧ-6 типа.

Медицинский эксперт-редактор

Портнов Алексей Александрович

Образование: Киевский Национальный Медицинский Университет им. А.А. Богомольца, специальность - "Лечебное дело"

Другие врачи

!
Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.




Новейшие исследования по теме Диагностика герпеса

Согласно статистическим данным, 20% всего населения планеты инфицированы генитальным герпесом, но 80% об этом даже не подозревают.

В одном из известных исследовательских университетов США, расположенном в штате Юта, группа вирусологов случайным образом обнаружила, что сердечное лекарство помогает справиться с самыми распространенными герпевирусами.

Поделись в социальных сетях

Сообщите нам об ошибке в этом тексте:
Просто нажмите кнопку "Отправить отчет" для отправки нам уведомления. Так же Вы можете добавить комментарий.